rip实验结果图

小编和大家分享一篇于2023年10月发表在cell death & disease杂志上的文章，影响因子为9.0分。长编码RNA（lncRNAs）是一种长度超过200个核苷酸的功能RNA分子，没有蛋白质编码能力，通过多种机制在各种癌症中发挥着至关重要的作用。LncRNAs不仅在表观遗传和转录水平参与基因调控，而且通过与RNA和蛋白的相互作用在转录后和翻译水平参与基因调控。本篇文章利用公共数据库的卵巢癌（OC）数据中发现长链非编码RNA NRSN2-AS1在OC中显著高表达。采用RNA pull-down与LC-MS/MS分析检测与NRSN2-AS1相互作用的潜在蛋白。进而深入研究NRSN2-AS1在肿瘤中的功能。接下来让我们一起学习一下这篇文章吧。

亮点导读

• 利用公共数据库找到有意义的长链非编码RNA NRSN2-AS1。
• 采用RNA pull-down与LC-MS/MS分析检测与NRSN2-AS1相互作用的潜在蛋白。
• 基于三维（3D）结构，利用HawkDock预测NRSN2-AS1与其互作蛋白PTK2之间的结合袋，并利用PyMOL进行可视化。
• 实验表明PTK2参与了β-连环蛋白信号通路的激活。
• 生信分析表明NRSN2-AS1与PTK2、PTK2与β-连环蛋白、NRSN2-AS1与β-连环蛋白之间存在显著正相关。
• IP实验表明NRSN2-AS1以抑制MG-53诱导的PTK2多泛素化和降解的方式调控PTK2/β-连环蛋白通路。

研究背景

卵巢癌（OC）是恶性程度最高的妇科肿瘤，严重危害女性的健康，降低生活质量。由于OC早期症状不典型，侵袭性高，患者5年生存率为20-40%。目前迫切需要寻找合适的OC生物标志物。

lncRNA NRSN2-AS1（NCBI: NR_109990.1, Ensemble: ENSG00000225377）位于20号染色体上，全长5566-bp。最新的研究发现，NRSN2-AS1同时位于癌细胞的细胞质和细胞核中。在Huang等人最近进行的一项研究中，NRSN2-AS1的表达水平与免疫细胞浸润呈显著正相关，并参与了肝细胞癌中的过氧化物酶体和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路。然而，NRSN2-AS1在肿瘤中的功能仍需进一步进行更深入的研究。

结果显示

1、 NRSN2-AS1的表达与OC的进展呈正相关。

TCGA数据中NRSN2-AS1在OC组织中显著过表达（图1A），NRSN2-AS1高表达与不良预后相关（图1B，C）。此外，通过多因素Cox回归分析发现，NRSN2-AS1的表达、年龄和分期与OC预后显著相关。通过RT-qPCR和FISH检测证实，在OC患者组织中也发现了较高的NRSN2-AS1水平（图1D-F）。相对于正常卵巢上皮细胞（IOSE80），NRSN2-AS1在OVCAR3和A2780细胞系高表达（图1G）。因此，本篇作者使用OVCAR3和A2780细胞系进行进一步分析。结果显示使用NRSN2- AS1 si-RNA显著降低了体外OVCAR3和A2780细胞的细胞活力、集落形成和迁移能力（图1H-M）。此外，在sh-NRSN2-AS1组的异种移植瘤中，Ki67+细胞的体积较小，数量较少。sh-NRSN2-AS1组肺中转移性结节减少，E-钙粘蛋白阳性细胞增加，N-钙粘蛋白和波形蛋白阳性细胞减少（图1N-W）。

Fig. 1. NRSN2-AS1 is significantly upregulated in OC and its levels are tightly correlated with OC progression both in vitro and in vivo.

2、 NRSN2-AS1与PTK2相互作用。

采用RNA pull-down与LC-MS/MS分析检测与NRSN2-AS1相互作用的潜在蛋白（图2A）。三个独立的RNA下拉分析的维恩图显示有30个蛋白质交集（图2b和表S4）。其中包括PTK2，也被称为黏附激酶（FAK），据报道它参与了各种肿瘤类型的进展。TCGA数据分析表明PTK2在OC组织中的表达量高于正常组织（图2C）。

基于三维（3D）结构，利用HawkDock预测NRSN2-AS1与PTK2之间的结合袋，并利用PyMOL进行可视化（图2D）。由NRSN2-AS1的35-82残基和PTK2的414-670残基组成（图2e和表S5）。随后，通过共免疫染色证实了NRSN2-AS1和PTK2在OC细胞中的共定位（图2F，G）。此外，RNA pull-down western blot和RIP-qPCR实验证实NRSN2- AS1与PTK2相互作用（图2H，I）。

Fig. 2. NRSN2-AS1 interacts with PTK2.

3、PTK2促进细胞增殖和迁移，并与OC细胞中的β-连环蛋白信号通路的激活有关。

分别用si-PTK2和si-NC转染OVCAR3和A2780细胞，探讨PTK2对OC细胞的影响。PTK2的下调降低了细胞增殖，包括细胞活力和集落形成（图3a-d）。此外，PTK2敲降后，细胞迁移能力也显著降低（图3E，F）。总之，敲除PTK2抑制了体外OC细胞的增殖和迁移。

β-连环蛋白信号通路已经涉及到人类癌症的多个方面，包括肿瘤的发生、进展和恶性侵袭。在各种癌症中，β-连环蛋白被异常激活，包括OC。大多数β-连环蛋白位于细胞质中，通过与E-钙粘蛋白的相互作用来维持细胞间的粘附。在细胞核中，β-连环蛋白结合T细胞因子/淋巴样增强子激活下游基因，导致肿瘤细胞异常的增殖和迁移。如图所示（图3G），研究表明PTK2参与了β-连环蛋白信号通路的激活。一方面，PTK2可以直接磷酸化β-连环蛋白y142，促进其易位到核中。另一方面，PTK2可以磷酸化GSK3Y279/Y216，促进E3连接酶β-TrCP（β转导重复蛋白）介导的泛素化降解，从而稳定总β-连环蛋白的表达（图3G）。通过蛋白印迹法发现PTK2敲除导致OVCAR3和A2780细胞中β-连环蛋白Y142、GSK3Y279/Y216和总-β-连环蛋白的表达降低（图3H，I）。综上所述，上述结果表明，PTK2也可能在OC细胞中触发β-连环蛋白通路。

Fig. 3 Effects and underlying mechanisms of PTK2 in OC cells.

4、敲除NRSN2-AS1可以降低PTK2蛋白的表达，并阻断β-连环蛋白的激活。

采用蛋白印迹法阐明NRSN2-AS1对PTK2/β-连环蛋白通路的影响。在NRSN2-AS1敲除的OC细胞中，PTK2、β-cateninY142、GSK3Y279/Y216和总β-连环蛋白表达减少（图4A，B）。此外，免疫荧光证实，无论敲除NRSN2-AS1还是PTK2都会导致β-连环蛋白表达的显著丢失。细胞核中的减少更为明显（图4C、D）。除此之外，敲除NRSN2-AS1或PTK2导致TOP/FOP荧光素酶活性显著降低(图S2)。因此，NRSN2-AS1和PTK2的敲除都阻断了β-连环蛋白的激活。

Fig. 4. Potential molecular mechanisms involving NRSN2-AS1 and PTK2/β-catenin pathway in OC cells.

5、NRSN2-AS1以一种依赖于β-连环蛋白信号通路的方式促进OC的增殖和迁移。

为了进一步验证β-连环蛋白在与NRSN2-AS1相关的OC进展中的关键作用，本篇文章研究人员将小分子β-连环蛋白激动剂SKL2001应用于NRSN2-AS1敲除的OVCAR3和A2780细胞。经SKL2001处理后，β-连环蛋白Y142和总β-连环蛋白的表达均显著增强（图5A，B）。此外，功能缺失分析显示，在NRSN2-AS1敲除组中，β-连环蛋白的激活可以逆转体外细胞的增殖和迁移（图5C-H）。

Fig. 5. Effects of NRSN2-AS1/β-catenin pathway in OC cells.

6、NRSN2-AS1通过靶向PTK2/β-连环蛋白轴促进OC进展。

为了进一步证明PTK2/β-连环蛋白轴在NRSN2-AS1介导的OC进展中的作用，研究人员将si-PTK2和XAV-9399（β-连环蛋白的小分子抑制剂）应用于过表达NRSN2-AS1的OVCAR3和A2780细胞。结果表明，过表达NRSN2-AS1后，PTK2、GSK3Y279/Y216、β-连环蛋白Y142和总β-连环蛋白的表达显著增加，而PTK2敲除则降低了PTK2、GSK3Y279/Y216、β-连环蛋白Y142和总β-连环蛋白的表达。而通过XAV-939抑制β-连环蛋白也降低了β-连环蛋白Y142和总β-连环蛋白的蛋白水平，但没有降低PTK2或GSK3Y279/Y216的蛋白水平（图6A，B）。此外，细胞功能分析表明，抑制PTK2和β-连环蛋白可显著抑制过表达NRSN2-AS1的OC细胞的增殖和迁移（图6C-G）。

TCGA数据库OC患者临床数据分析显示NRSN2-AS1与PTK2、PTK2与β-连环蛋白、NRSN2-AS1与β-连环蛋白之间存在显著正相关(图。S3A)。此外，使用整合的NRSN2-AS1/PTK2/β-连环蛋白基因特征进行生存分析，发现在OC中表达量越高，总生存率越差(图S3B)。此外，ROC曲线分析进一步阐明了整合的NRSN2-AS1/PTK2/β-连环蛋白基因特征的潜在预后价值。在3、5和8年时，曲线下面积（AUC）分别为0.520、0.580和0.683 S3C)。

为了研究NRSN2-AS1/PTK2/β-连环蛋白网络在OC细胞的间充质/上皮标记物表达中的作用，研究人员对EMT标记物上的NRSN2-AS1/PTK2/β-连环蛋白网络进行了RT-qPCR分析。NRSN2-AS1敲除可以下调一些间充质标记物（TWIST、NCAD、SNAIL、SLUG、ZEB1）的表达，上调上皮标记物（ECAD），而SKL2001可以部分逆转OVCAR3和A2780中的表达。S2A)(图S4A)。相反，过表达NRSN2-AS1可以促进EMT，而si-PTK2和XAV939可以部分逆转EMT(图S4B)。随着NRSN2-AS1/PTK2/β-连环蛋白网络的变化，EMT有减少/增加的趋势，但部分差异无统计学意义。

最后，分析了PTK2和β-连环蛋白在从OVCAR3细胞衍生的异种移植瘤中的表达。免疫荧光结果显示，与对照组相比，sh-NRSN2-AS1组的PTK2和β-连环蛋白信号降低(图S4C, D)。这些结果表明NRSN2-AS1可能通过靶向PTK2/β-连环蛋白轴来促进OC的进展。

Fig. 6 Effects of NRSN2-AS1/PTK2/β-catenin pathway in OC cells.

7、 NRSN2-AS1可以保护PTK2免受OC中E3连接酶MG-53的多泛素化降解。

在本研究中表明NRSN2-AS1影响了PTK2的蛋白水平（图4A，B）。因此，研究人员通过CHX检测方法评估了在OC细胞中，在没有NRSN2-AS1的情况下，PTK2的稳定性。NRSN2-AS1敲除后，PTK2的蛋白稳定性显著降低（图7A，B）。此外，IP检测显示，转染了si-NRSN2-AS1的OC细胞显示出更高水平的PTK2多泛素化。（图7C)。蛋白酶体可以特异性识别标记有K48泛素链的底物蛋白，进而将其降解。在本研究中，Lys-48显然是PTK2泛素化的关键赖氨酸（图7C）。肌肉特异性蛋白MG53（又称TRIM72）已被报道在骨骼肌生成过程中诱导PTK2泛素化和降解。IP检测也证实了在NRSN2-AS1敲除的OC细胞中，MG53和PTK2之间的相互作用增强（图7C），这就提出了NRSN2-AS1可能通过阻断MG53在OC细胞中介导的泛素化和降解来稳定PTK2的可能性。

根据TCGA数据（图7D）和23对临床样本（图7E），OC组织的MG53水平明显低于正常组织。此外，功能获得试验表明，MG53在体外抑制了OC细胞的增殖和迁移（图7f-j）。这些结果表明，MG53在OC中似乎具有抑瘤作用。

为了阐明MG53在NRSN2-AS1与PTK2相互作用中的机制，IP检测MG53显著促进了OC细胞中PTK2的总泛素化和k48连接的多泛素化（图7K）。此外，MG53的敲除降低了OC细胞中NRSN2-AS1敲除导致的PTK2泛素化水平的增加（图7L）。同样，当MG53同时过表达时，NRSN2-AS1失去了抑制PTK2泛素化的能力（图7M）。最后，western blot结果显示，MG53敲除可以恢复NRSN2-AS1沉默诱导的PTK2/β-连环蛋白的表达（图7N，O），而过表达MG53可以降低NRSN2-AS1上调激活的PTK2/β-连环蛋白信号通路（图7P，Q）。因此，研究人员得出结论，NRSN2-AS1以抑制MG-53诱导的PTK2多泛素化和降解的方式调控PTK2/β-连环蛋白通路。

Fig. 7 Effects of MG53 on NRSN2-AS1/PTK2/β-catenin pathway in OC cells.

小编寄语

卵巢癌其死亡率在妇科恶性肿瘤中排名第一，严重威胁女性生命健康。由于疾病开始时没有特异性生物标志物，也没有典型的临床症状，超过 70% 的病例在诊断时已进展到晚期。此外，在细胞减灭术和铂类化疗作为一线治疗后，一些OC患者可能会出现化疗耐药或复发。因此，OC的早期检测和潜在的治疗靶点极为重要。lncRNA在肿瘤的发生发展中具有多种作用，它以ceRNA方式作为海绵吸附miRNA从而调控相关基因的表达，也可以协同转录因子激活相关基因的表达或者结合蛋白防止蛋白降解从而促进蛋白相关功能的发挥。

原名：Long non-coding RNA NRSN2-AS1 promotes ovarian cancer

progression through targeting PTK2/β-catenin pathway

译名：长链非编码RNA NRSN2-AS1通过靶向PTK2/β-连环蛋白通路促进卵巢癌的进展

期刊：cell death & disease

影响因子：9.0

发表时间：2023.10.24

DOI: 10.1038/s41419-023-06214-z.

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