t检验结果p值+0.05

2023年1月，京都大学医学部Rei Mizuno于《Int J Mol Sci》 (IF=5.6)杂志上发布了文章《Neutrophil Extracellular Traps Promote Metastases of Colorectal Cancers through Activation of ERK Signaling by Releasing Neutrophil Elastase》。该研究 揭示了 NETs的形成与结直肠癌患者的不良预后有关，抑制NE有希望成为控制结直肠癌转移的潜在治疗方案。

摘要

体外研究结果表明，尽管并不影响结直肠癌细胞的增殖，但中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）能够促进结直肠癌细胞的迁移。此外，体内研究结果显示，西维来司他钠抑制NE活性能够有效抑制结直肠癌（CRC）细胞的肝转移。体内外结果共同揭示NETs的形成与结直肠癌患者的不良预后有关，抑制NE有希望成为控制结直肠癌转移的潜在治疗方案。

结直肠癌（ CRC）是继乳腺癌和肺癌之后全球第三大最常见的恶性疾病，数据显示，至少三分之一的CRC患者发生肝转移，而CRC相关死亡大多数归因于远处转移。

多项研究表明NETs在促进癌细胞进展中发挥重要作用。NETs由活化的中性粒细胞释放，是包括髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase, NE)和MMPs相关DNA的细胞外网状结构。在正常生理情况下，NETs被用以捕获、中和病原体，在肿瘤微环境中，NETs能够捕获肿瘤细胞，从而促进癌细胞的迁移。本研究中，作者旨在探讨NETs与CRC的临床相关性，NETs对CRC细胞的影响及其潜在机制，以及NETs作为CRC潜在治疗靶点的可能性。

本研究中，研究者发现，在没有远处转移的CRC患者中，瘤内/全身NETs的高表达与较差的无复发生存期(Relapse-free Survival, RFS)相关。体外研究结果表明，NETs形成过程中释放的NE能够激活细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-regulated Kinase, ERK）进而促进CRC细胞的迁移。借助小鼠CRC肝转移模型，作者进一步发现，抑制NE可显著减少肝转移CRC细胞的形成，这表明抑制NE有望成为控制结直肠癌转移的潜在治疗方案。

1 NETs的形成与CRC患者不良预后相关

为了评估NETs与CRC的临床相关性，作者通过免疫组化(IHC)检测来自133例接受根治性切除手术的I、II和III期CRC患者样本中的中性粒细胞标志物(MPO、MMP-9和NE)以及NETs标志物瓜氨酸化组蛋白H3 (Cit-H3)的表达。结果显示Cit-H3的表达与上述中性粒细胞标记物的表达共定位，这一结果表明NETs在结直肠癌组织中的诱导作用(图1A)。作者进一步分析患者的总生存期(Overall Survival, OS)和RFS，发现Cit-H3高表达与较差的RFS显著相关(P = 0.009)。Cit-H3高表达组呈现较差的OS，尽管并没有表现出统计学差异(P = 0.054)(图1B)。

血清MPO-DNA是NETs形成的标志。为了进一步评估NETs在结直肠癌患者中的临床意义，作者检测了67例II期和III期结直肠癌患者的术前血清MPO-DNA水平，并根据8名健康志愿者血清中MPO-DNA的平均水平，将患者分为高MPO-DNA组(n = 31)和低MPO-DNA组(n = 36)。接下来，通过比较高MPO-DNA组和低MPO-DNA组间的OS和RFS，作者发现术前血清MPO-DNA水平高与较差的RFS显著相关(P = 0.018)，而OS差异无统计学意义(P = 0.43)(图1C)

(A) 原发性CRC标本中MPO，Cit-H3，MMP9和NE的H&E和IHC染色。上图和下图分别显示了CRC标本中Cit-H3高表达和低表达的连续切片。比例尺：500 μm。右上角呈现放大图。比例尺：100 μm；(B) Cit-H3表达对接受根治性切除I - III期CRC患者的RFS(右)和OS(左)的影响；(C) 术前血清MPO-DNA水平对接受根治性切除手术II期和III期CRC患者的RFS(右)和OS(右)的影响

接下来，作者研究了RFS的潜在预后因素(表1)。单因素分析显示，较差的RFS与n因子、淋巴浸润、术前治疗和Cit-H3的高表达显著相关。采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，n因子(HR 3.26, 95% CI 1.38 ~ 7.70, P = 0.0071)和Cit-H3高表达(HR 2.86, 95% CI 1.25 ~ 6.54, P = 0.013)仍与较差的RFS显著相关。

表1 133例结直肠癌患者RFS的临床病理特征和Cit-H3表达的单因素和多因素分析

NLR，中性粒细胞淋巴细胞比率；CEA，癌胚抗原；CA19-9，糖类抗原19-9；HR，风险比

接下来，作者调查了RFS的潜在预后因素(表2)。单因素和多因素分析显示，性别(HR 0.26, 95% CI 0.10-0.72, P = 0.009)、脉管侵犯(HR 5.69, 95% CI 1.58-20.51, P = 0.008)、肿瘤标志物CA19-9高水平(HR 3.16, 95% CI 1.07-9.22, P = 0.036)和MPO-DNA高水平(HR 3.53, 95% CI 1.31-9.56, P = 0.013)与较差的RFS显著相关。以上这些结果表明肿瘤内和全身NETs的形成与CRC患者不良预后相关。

表2 67例CRC患者RFS的临床病理特征和血清MPO-DNA水平的单因素和多因素分析

2 NETs通过释放NE加速CRC细胞的迁移

作者进一步在体外评估了NETs对人CRC细胞系的影响。在体外研究中他们使用从健康志愿者中分离的人类中性粒细胞和人类CRC细胞系HCT116和HT29。为了研究NETs形成过程中释放物质的影响，他们进一步收集了经处理的人中性粒细胞上清，并将其作为NET条件培养基(NET-conditioned Medium, NET-CM)进行后续实验。首先，作者评估了NET-CM对CRC细胞增殖的影响，然而，没有观察到明显的影响(图2A)。他们还通过伤口愈合实验分析了其对CRC细胞迁移的影响，发现与对照培养基相比，NET-CM显著加速了CRC细胞的迁移(图2B)。鉴于NE是NETs形成所必需的，作者进一步评估了NE对HCT116和HT29细胞迁移的影响，发现NE能显著促进迁移(图2C)，并且这种促进可以被NE抑制剂西维来司他钠抑制。此外，由NET-CM诱导的CRC细胞迁移也能够被西维来司他钠抑制(图2C)。这些结果表明，NE在NETs促进CRC细胞迁移的机制中发挥了重要作用。

(A) HCT116和HT29细胞的细胞增殖检测。将细胞与NET-CM或嗜中性粒细胞对照培养基一起孵育，并在0, 24, 48和72小时分析。将0h的吸光度归一化为1。平均值：误差棒±标准误，N = 3。Ns：t检验统计学差异不显著；(B) 伤口愈合实验。将HCT116和HT29细胞与NET-CM或嗜中性粒细胞对照培养基孵育并用100 μM西维来司他钠处理。图比例尺：500 μm。(C) 在0, 24和48小时测量伤口宽度。将0 h的间隙宽度归一化为1。平均值：误差棒±标准差，N = 6。使用t检验P < 0.05视为有统计学意义。

3 ERK是由NETs诱导的活化细胞迁移的重要调控因子

接下来，作者进一步研究了NE激活CRC细胞迁移的分子机制。有研究报道ERK是各种类型细胞中细胞迁移的关键调控因子。因此，作者研究了NET-CM或NE引起的CRC细胞迁移是否受到ERK的调节。实验结果显示，在给药NET-CM或NE后20分钟内，HCT116细胞中的ERK活性显著升高，而西维来司他钠可以阻断这一过程(图3A-C)。在伤口愈合实验中，NET-CM或NE对HCT116和HT29细胞的细胞迁移能力的促进能够被ERK活性抑制剂MEK抑制剂阻断(图3D)。这些结果表明，ERK作为NET-CM或NE的下游分子，在促进CRC细胞迁移中发挥了重要作用。

(A) 利用ERK生物传感器在HCT116细胞中实现FRET活细胞成像。将HCT116细胞用无血清处理6小时。用10 μg/mL NE或100 μM西维来司他钠处理与NET-CM孵育的细胞。以调强方式显示处理前/处理后的FRET/CFP比值图像。图片比例尺：10 μm。(B) HCT116细胞治疗前后ERK活性(FRET/CFP)的变化。每个点代表每个细胞的ERK活性。共分析了54个细胞。红色条表示平均值。(C) 在加入NET-CM之前和之后HCT116细胞的标准化ERK活性(FRET/CFP)的增加率。结果表示为三次测量的平均值±标准误。使用t检验，P < 0.05视为有统计学意义。(D) 用10 nM MEK抑制剂处理与NET-CM孵育的HCT116和HT29细胞。分别在0, 24和48小时测量伤口宽度。将0 h的间隙宽度归一化为1。平均值：误差棒±标准差，N = 3。使用t检验P < 0.05视为有统计学意义。

4 抑制NE能够抑制NET的形成导致CRC细胞肝转移减少

作者进一步通过体内研究评估了NE抑制的治疗潜力。他们将HCT116细胞种植到7 - 8周龄雌性KSN/slc裸鼠的背侧，并评估西维来司他钠治疗对肿瘤生长的影响。实验中，对照组和西维来司他钠组小鼠分别经皮下注射NET-CM或NET-CM加西维来司他钠预孵育的HCT116细胞。从种植HCT116细胞的前一天开始，每天以腹腔注射的形式为小鼠给药溶剂或西维来司他钠(10 mg/kg, CAYMAN)。在治疗5周后，对照组和西维来司他钠组肿瘤大小未见明显差异，但西维来司他钠组成功抑制了NETs，结果显示Cit-H3表达下降(图4A-D)。正如预期的那样，小鼠肿瘤中ki67阳性细胞的比例没有显著差异(图4E)，这一结果与前期的体外研究结果一致，即NETs不影响CRC细胞增殖。

(A) 用西维来司他钠(10 mg/kg)或溶剂对照处理的KSN/slc裸鼠中HCT116的皮下移植肿瘤的生长曲线。平均值：误差棒±标准误，N = 6。t检验P < 0.05视为有统计学意义。(B) 在第35天用西维来司他钠(10 mg/kg)或溶剂对照处理的KSN/slc裸鼠解剖的HCT116细胞的皮下移植肿瘤图。比例尺：10 mm。(C) 小鼠皮下移植肿瘤H&E染色以及Cit-H3和Ki-67的IHC染色。H&E染色，比例尺：500 μm。Cit-H3，Ki-67的IHC染色，比例尺：200 μm。(D，E) 小鼠皮下移植肿瘤IHC染色中Cit-H3阳性细胞的定量(D)和Ki-67阳性细胞的百分比(E)，平均值：误差棒±标准误，N=6，t检验P < 0.05视为有统计学意义。

接下来，作者利用小鼠CRC肝转移模型进一步评估NE对CRC细胞转移的影响。他们将表达荧光素酶的HCT116-luc注射到裸鼠脾脏中，利用生物发光技术对肝脏转移的肿瘤细胞定量。在注射HCT116-Luc前一天开始，每天通过腹腔注射裸鼠10 mg/kg西维来司他钠或对照物。数据显示，对照组在注射HCT116-Luc后不久生物发光强度开始增加，而西维来司他钠组则在注射2周后生物发光强度开始增加。注射2周后，西维来司他钠组生物发光强度较对照组明显降低(P < 0.05)(图5A, B)。两周后，两组的生物发光强度以相似的速度增加(图5A)。5周后处死小鼠，小鼠解剖组织图片证实了西维来司他钠组肝转移的减少(图5C)。免疫组化结果提示，相较于对照组，西维来司他钠治疗组小鼠肝转移灶中CitH3的表达降低，这也表明西维来司他钠成功抑制了NETs的形成。此外，两组间ki -67阳性细胞比例未见明显变化(图5D-F)。这些结果表明，尽管抑制NE对CRC细胞的增殖没有明显影响，但能够抑制肿瘤细胞向肝组织的浸润，这也解释了注射HCT116-Luc后头两周生物发光增加的延迟。这些结果表明，利用西维来司他钠抑制NE有望成为控制结直肠癌转移的潜在治疗方案(图5G)。

(A) 西维来司他钠(10 mg/kg)或溶剂对照处理后的KSN/slc裸鼠中HCT116-luc肝转移病变(光子计数)的定量。平均值：误差棒±标准误，N=9，Mann-Whitney U 检验，P < 0.05视为有统计学意义；(B)西维来司他钠(10 mg/kg)或溶剂对照处理的KSN/slc裸鼠中HCT116-luc肝转移的体内生物发光图像；(C) 西维来司他钠(10 mg/kg)或溶剂对照处理后第35天KSN/slc裸鼠解剖的HCT116-Luc肝转移肿瘤的体内生物发光图像，比例尺：10 mm；(D) 小鼠肝转移瘤H&E染色以及Cit-H3和Ki-67的IHC染色。H&E染色，比例尺：500 μm。Cit-H3，Ki-67的IHC染色，比例尺：200 μm；(E, F) 肿瘤免疫组化染色中Cit-H3阳性细胞(E)和Ki-67阳性细胞百分比(F)的定量，平均值：误差棒±标准误，N=9，t检验，P < 0.05视为有统计学意义。(G) NETs促进CRC细胞肝转移可能机制的示意图，NETosis期间释放的NE能够增加ERK活性，从而促进CRC细胞的迁移；抑制NE则会抑制NETosis和CRC细胞的迁移，从而减少肝转移。

本研究中，作者发现肿瘤内或全身NETs高表达的CRC患者呈现明显较差的RFS，并进一步通过多因素分析验证肿瘤内或全身NETs高表达是CRC患者不良预后的独立预测因素。此外，作者进一步发现NE能够激活CRC细胞中的ERK进而参与CRC转移，但NETs在体内外均不影响CRC细胞的增殖。作者的结果与之前的一些研究相似，这些研究表明，NETs在卵巢癌、胰腺癌、头颈癌中并不影响肿瘤细胞增殖，而是促进细胞迁移。

在研究中，作者进一步证明NE抑制剂西维来司他钠治疗能够显著抑制NETosis和减少肝转移。目前西维来司他钠已被批准用于治疗急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）/急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS），这一研究结果表明西维来司他钠在抑制CRC转移上也存在治疗潜力。这项研究也存在部分局限性，例如患者是从单中心招募的，样本量相对较小。此外，作者重点研究了NE在NETs形成过程中的作用。需要进一步分析其他组分对CRC的影响，以揭示NETs促进CRC进展的详细机制。

总之，尽管存在一定局限性，本研究证明了NETs与CRC患者的不良预后相关，并且是CRC患者不良预后的独立预测因子。而NETs形成过程中所释放的NE能够激活ERK进而促进CRC细胞的迁移。此外，在小鼠CRC肝转移模型中证明抑制NE可显著减少CRC细胞肝转移的形成，这预示着抑制NE可能是治疗CRC转移的一种潜在策略。

参考文献：

Okamoto M, Mizuno R, Kawada K, et al. NeutroPhil Extracellular TraPs Promote Metastases of Colorectal Cancers through Activation of ERK Signaling by Releasing NeutroPhil Elastase. Int J Mol Sci. 2023 Jan 6;24(2):1118. doi: 10.3390/ijms24021118. PMID: 36674635; PMCID: PMC9867023.

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