一个六孔板的细胞数量

一、原理

噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜

（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数 量。

二、试剂材料准备与实验仪器

1）对数生长期细胞

2）受试因素（药物）

3）MTT：以 PBS 配制成 5mg /ml，抽滤除菌，保存在 4˚C

4）DMSO（二甲基亚砜）

5）96 孔板

6）酶联免疫检测仪

7）细胞培养箱

三、实验步骤（适用于贴壁细胞）

1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。

2）置 37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁。

3）加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml 的药物，时间依 据实验需要，一般 3 天。

4）小心吸去上清，PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

5）每孔加入 180 ul 新鲜 RPMI 1640 培养液，再加入 20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即

0.5%MTT），继续培养 4 h。

6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。

7）每孔加入 150 ul 二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS 代替），置摇床上低速 振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。 8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解 介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。

三、结果统计学处理

所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p<0.05 时为相差显著，p<0.01 时 为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求 IC50。 或计算抑制率。

四、注意事项与常见问题 

1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照 孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质， 而加药组加入不同浓度的药物。

 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降 低，太少观察不到差异。

3）贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为20ul/孔。

4）如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 ml，MTT 按照 10%的比例加入。

5）MTT 一般 4 度保存两周，注意避光保存，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存， 避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后 可过滤一下。

6）对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm 有最大吸收值；而对于 SDS 和酸化异丙醇，

则选用 570nm，并且建议以 655nm 作为参考波长。

7）96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分 蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保 证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。 

8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每 接几个就要再混匀一下。

9）没有去掉上清直接加 DMSO，沉淀会很难溶解。加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液 里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心 96 孔板，2000r，5 分钟， 然后吸掉上清。加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。 

10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。

11）除置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶。 

12）关于如何计算 IC50 方法有多种 

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) 

(2)Bliss 法:自己查阅书籍

(3) IC50 计算软件，见下面附件（暂时找不到了）

(4)自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50，关于 LD50 的方法与此相似！

(5)在线求 IC50 或 EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm 13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.

惠玉券1325请教:25ML细胞培养瓶长到70 - 80融合时 细胞数量大概是多少? -
郗战闸17160513188 ______ 100ml的大概在10的6次方左右.25ml的大概在10的5次方左右.跟六孔板的一个孔差不多吧.

惠玉券1325心肌成纤维细胞占心脏细胞总数的多少 -
郗战闸17160513188 ______ 心肌成纤维细胞和心肌细胞细胞总数占整个心脏细胞数的90%左右,而心肌成纤维细胞就占了60%-70%.

惠玉券1325细胞培养用多少培养基一般培养瓶和培养皿以及六孔 -
郗战闸17160513188 ______ 细胞培养用多少培养基一般培养瓶和培养皿以及六孔 不同细胞可能长满细胞数是不同的,对于同一种细胞,你可以计数几次,以后就可以大致知道有多少.但是一般做实验种细胞的时候都会计数,虽然不是很准确,这是个精度的问题,但是它保证了基本每次的都在一个数量级,不至于相差太离谱.一般组织块原代培养时用培养瓶,长出的细胞传代后就可以依个人喜好而定了,用培养瓶或培养皿都可以,只要注意无菌操作都是没问题的.不过个人更偏向于用培养皿,操作更方便些.

惠玉券1325胃癌7901细胞计数24孔板每孔应该接种多少个细胞呀 -
郗战闸17160513188 ______ 根据细胞生长的速度来决定,96孔板的每孔体积100~200ul,种细胞数一般都是2000~10000个/孔,最好不要超过10000个/孔. 同理,24孔板每孔大约500ul,那么细胞数一万为佳.

惠玉券1325请问细胞培养到多大密度就可以接种到六孔板上了? -
郗战闸17160513188 ______ 生长速度非常快的癌细胞,48孔板长满即可接种到6孔板了,其他生长速度较慢的有限细胞系,则要24孔板或12孔板长满才能接种到6孔板.

惠玉券1325如何把细胞铺的更均匀 -
郗战闸17160513188 ______ 做细胞生物学实验,细胞铺板大概是最常见的一个实验了.但是有很多人不是很得要领,铺得不是均匀: 要么中间密周围稀,要么周围密中间秃顶.现分享我的实验技巧. 一般 96 孔板我每孔是加 100 微升细胞悬液,从孔的左边靠近底部加入...

惠玉券1325做SKOV3和SMMC - 7721的MTT实验,请问MTT实验中96孔板中的合适细胞数或者浓度. -
郗战闸17160513188 ______ 博凌科为解答:调整细胞浓度至1*105/ml,分别加入96孔板,每孔加200μL使每孔细胞数目是2*104个.

惠玉券1325想要把1*106的CD4细胞接种在6孔板种,预计用1ml培养基,请问合适吗? -
郗战闸17160513188 ______ 培养细胞的时候接种用的细胞量不是那么死的,在现在的情况下,如果你希望它长两天到达覆盖孔100%的话,在现有基础上当然要减少接种的细胞数量,而且最好24小时更换一次培养液.只要你的其他部分操作啊试剂啊没问题,那就减少细胞用量. 或者你一直发现这批细胞的状态怎么养也养不好,那就去重新复苏一批细胞吧~~ 希望能够帮到你~有问题一起讨论解决哦~

惠玉券1325想要把1*106的CD4细胞接种在6孔板种,预计用1ml培养基,请问合适吗?之前用的12孔板,1*106个细胞用的1ml培养基,但是培养48小时后死细胞太多了,... -
郗战闸17160513188 ______[答案] 培养细胞的时候接种用的细胞量不是那么死的,在现在的情况下,如果你希望它长两天到达覆盖孔100%的话,在现有基础上当然要减少接种的细胞数量,而且最好24小时更换一次培养液.只要你的其他部分操作啊试剂啊没问题,那就减少细胞用量. ...

惠玉券13256孔板一般用多少细胞营养液 -
郗战闸17160513188 ______[答案] 2ml