双酶切电泳条带分析
贺委磊2946DNA酶切以及电泳的结果应如何分析 -
焦胡舒17131896051 ______[答案] 你切完之后不点Marker的吗?根据marker你可以判断你的条带大小啊!我们这边用的DNA MARKER III 从上到下条带大小分别为4500bp 3000bp 2000bp 1200bp 800bp 500bp 300bp 100bp.然后你 就可以估算出大小了啊.如果你只是...
贺委磊2946酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事? -
焦胡舒17131896051 ______ 建议你做如下改进: 1. 原始质粒上样2ul,电泳检测,确定质粒质量没问题; 2. 所有酶切体系均改为10ul,其中质粒2ul,酶0.1ul (双酶切时另一种酶也加0.1ul ),buffer终浓度为 1*,剩下为去离子水.酶切时间为4小时左右. 3.电泳用的凝胶最好为新鲜配制的,浓度视质粒大小而定,一般为1%; 电泳的缓冲液最好也是新鲜配制的,电泳电压适当. 1KB的条带拖尾严重,可能是凝胶不新鲜,或者是电泳时电压过高,或者是酶切时间过长.上述建议中已经给出解决方法. 至于你说的奇怪现象,可能质粒已经降解,也可能是酶切过久导致降解,也可能是枪头或者离心管等器材污染,总之保证一切是新鲜的,再做一次.
贺委磊2946怎样判断双酶切后是否成功获得目的片段 -
焦胡舒17131896051 ______ 这个问题好像比较混.酶切切开走胶看小片段啊,如果你看到了小片段那就认为有切开但不一定是完全.如果那是那种两个位点之间很小,那么只能看到片段,没有切开的是超螺旋跑在前面,且...
贺委磊2946为什么双酶切产物和连接产物电泳后会出现多个条?为什么双酶切产物和
焦胡舒17131896051 ______ 正常质粒是闭合的双链DNA.在电泳过程中可能使质粒发生开环,或者由开环解开螺旋变成线形.这三种形态电泳时的分离率不同,分离速度不同,分成三带.闭环(超螺旋),开环,线形的螺旋率依次降低
贺委磊2946对于载体的单酶切和双酶切,胶图分别会如何?为什么会这样啊?谢谢帮忙回答? -
焦胡舒17131896051 ______ 单酶切一个电泳道上会有几个比较亮的带,而且你所根据基因大小所选择的条带内也不一定是你要的.原因是单酶切形成的粘性末端完全相同,就像拼图,除了内容不同,两边完全切合.所以结合方式过多,可能性也多,如质粒和目的基因正确连接,质粒和目的基因反转连接,质粒和质粒连接,目的基因与目的基因的连接. 双酶切一般会有3条带,而且正确现象应只有一个是非常亮的.因为两种酶识别两个位点切开,无论是质粒还是目的片段两端的粘性末端完全不同,还是拼图,内容不同,两端切合口也不同,除了一种连接方式外没有其他连接了.胶途中3条带分别为:目的片段条带,空质粒条带,最亮的重组质粒条带.
贺委磊2946对PFGC1008载体进行双酶切,分别为ASCI和BAMHI,然后进行电泳切胶回收,但是发现酶切时为三条带? -
焦胡舒17131896051 ______ 可能是酶切效率比较低造成的,质粒完全没有被切开时为1条带,部分被切开时有3条带.需查验一下所使用的试剂和酶切条件参数是否有问题.
贺委磊2946重组质粒双酶切鉴定 -
焦胡舒17131896051 ______ 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了. 你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题. pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常. 换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.
贺委磊29461%琼脂糖电泳后,为什么看不到我的目的条带?我的目的条带是177bp,从质粒中双酶切后跑电泳,几乎看不到我的目的条带,是不是因为目的条带比较小,... -
焦胡舒17131896051 ______[答案] 条带短,能结合的EB(或其他染料)就少,所以相对长片段亮度就很弱,一般小于500就很难看清. 解决方案,基本上楼上的都提到了: 1.提高琼脂糖凝胶浓度到2%-3% 2.跑个单酶切对照,有差异就表示有连接进去.不过如果是要回收目的片段,建议...
贺委磊29461%琼脂糖电泳后,为什么看不到我的目的条带? -
焦胡舒17131896051 ______ 条带短,能结合的EB(或其他染料)就少,所以相对长片段亮度就很弱,一般小于500就很难看清.解决方案,基本上楼上的都提到了:1.提高琼脂糖凝胶浓度到2%-3%2.跑个单酶切对照,有差异就表示有连接进去.不过如果是要回收目的片段,建议还是用载体上的序列PCR扩增,而且回收小于400bp的DNA不太容易呵
贺委磊2946双酶切质粒后电泳 双酶切质粒pgl 6.24(5882bp)无共同buffer kPN I 2.5小时 bgl II 3.5小时 之后电泳 为什么出来1万多的带?跑的比原来质粒还有10000bp的... -
焦胡舒17131896051 ______[答案] 很显然是质粒发生了自连啦.切开的2个质粒连起来了,因此相当于2个质粒的大小.你需采用磷酸化避免自连发生.