用dmso溶解药物步骤

一、原理

噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜

（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数 量。

二、试剂材料准备与实验仪器

1）对数生长期细胞

2）受试因素（药物）

3）MTT：以 PBS 配制成 5mg /ml，抽滤除菌，保存在 4˚C

4）DMSO（二甲基亚砜）

5）96 孔板

6）酶联免疫检测仪

7）细胞培养箱

三、实验步骤（适用于贴壁细胞）

1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。

2）置 37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁。

3）加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml 的药物，时间依 据实验需要，一般 3 天。

4）小心吸去上清，PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

5）每孔加入 180 ul 新鲜 RPMI 1640 培养液，再加入 20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即

0.5%MTT），继续培养 4 h。

6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。

7）每孔加入 150 ul 二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS 代替），置摇床上低速 振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。 8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解 介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。

三、结果统计学处理

所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p<0.05 时为相差显著，p<0.01 时 为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求 IC50。 或计算抑制率。

四、注意事项与常见问题 

1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照 孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质， 而加药组加入不同浓度的药物。

 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降 低，太少观察不到差异。

3）贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为20ul/孔。

4）如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 ml，MTT 按照 10%的比例加入。

5）MTT 一般 4 度保存两周，注意避光保存，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存， 避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后 可过滤一下。

6）对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm 有最大吸收值；而对于 SDS 和酸化异丙醇，

则选用 570nm，并且建议以 655nm 作为参考波长。

7）96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分 蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保 证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。 

8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每 接几个就要再混匀一下。

9）没有去掉上清直接加 DMSO，沉淀会很难溶解。加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液 里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心 96 孔板，2000r，5 分钟， 然后吸掉上清。加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。 

10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。

11）除置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶。 

12）关于如何计算 IC50 方法有多种 

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) 

(2)Bliss 法:自己查阅书籍

(3) IC50 计算软件，见下面附件（暂时找不到了）

(4)自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50，关于 LD50 的方法与此相似！

(5)在线求 IC50 或 EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm 13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.

衡韵英5031贴壁细胞mtt试验原理及方法步骤是什么?详细点,,, -
查贷温18969262408 ______ MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础.MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下...

衡韵英5031用DMSO配制的药物可以直接加到细胞培养基里吗 -
查贷温18969262408 ______ 用DMSO配制的药物可以直接加到细胞培养基里吗 操作规范是不会有菌的啊,秤好药拿到超净台里去溶解,尽量减少在外面暴露的机会.

衡韵英5031药物制剂技术——处方分析 -
查贷温18969262408 ______ 我尽量回答您的问题,让您满意: 1.处方分析 硝酸咪康唑溶液处方 从上面处方来看,应该是外用制剂: 硝酸米康唑--主药 二甲亚DMSO--溶剂,兼有一定促进剂作用 森林果香精--矫味剂中的芳香剂 乙醇-------溶剂 (分析:硝酸米康唑极微溶于...

衡韵英5031黄芩苷如何溶解 -
查贷温18969262408 ______ 为了增加极性,但不是促溶,而是为了加大混合液中各成分的溶解度差异,为了更加分开,多几个峰出来.

衡韵英5031有些药物用dmso溶解后再稀释,仍然会有物质析出,怎么办 -
查贷温18969262408 ______ 不会析出来,关键是二甲基亚砜是有机溶剂,它对难溶性药物的溶解性虽然好,但我担心它自身不能溶于极性溶剂!你确定用培养基稀释的时候它不会像油那样的分层么?

衡韵英503118α - GA甘草酸粉末用什么溶解.本人用DMSO 溶液溶解,但溶液呈浑浊状,离心后沉在底部. -
查贷温18969262408 ______ 中午好,如果你用的是BR的甘草酸样品它是不溶于DMSO的(沉淀在底部,要是甘草酸粗粉含有其他杂质溶液就是黄褐色了),也试过它几乎不溶于极性溶剂亲水的醇、醇醚或者酮,但是在加热到60度条件下的温水里用PEG或者丙三醇增溶有较大溶解度,甘草酸和一些氨基酸相似对有机溶剂兼容比较差请酌情参考.其他你用丙二醇、吐温-20或者PPG物理增溶也行的.

衡韵英5031我要用槲皮素做大肠杆菌的MIC实验,但用DMSO溶解后用生理盐水稀释又变混浊了,求用DMSO溶解后该用什么稀释 -
查贷温18969262408 ______ 我们做的是肠吸收,用DMSO溶解后,加了一些聚氧乙烯氢化蓖麻油(ELP),然后再用肠吸收液稀释,溶质就不会析出了,你的应该也可以的,或者试试别的表面活性剂!这些附加的东西越少越好哦!

衡韵英5031我现在正在做放线菌的筛选,需要在培养基里加入制霉菌素,但是制霉菌素在水中的溶解度太低了 -
查贷温18969262408 ______ 溶解制霉菌素用的是二甲亚砜,把制霉菌素加入到灭菌的二甲亚砜中溶解,然后用0.22um微孔滤膜过滤.

衡韵英5031用什么方法能够除去DMSO -
查贷温18969262408 ______ 1、利用DMSO可溶于水的特点,用凝胶或者MCI,先用水冲,然后用甲醇冲洗,通过回收甲醇 ,得到样品. 2、减压蒸馏得到样品,这个方法感觉不好,DMSO的沸点很高,基本上很难回收回来. 3、利用可挥发性的溶剂如氯仿或甲醇,在水浴上挥干,重复几次,可以除去DMSO. 4、利用冷冻干燥的方法,低温挥去DMSO,得到样品.这种方法比较好,我就是利用冷冻干燥机,除去DMSO,得到较好的样品,假如实验室有这个条件,推荐用此种方法. 5、若dmso在有机层,多次水洗

衡韵英5031药粉不溶于DMSO怎么办 -
查贷温18969262408 ______ 换其它溶剂试试,比如THF,乙醇.如果还不溶解,就在加药之前涡旋使药粉成悬浮态.