细胞传代pbs洗有什么用
1 实验原理
细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养， 即将培养的细胞分散后，从一 个容器以 1：2 或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的 累积次数就是细胞的代数。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前 细胞冻存多采用甘油或 DMSO 作保护剂，这两种物质能提高 细胞膜对水的通透性，加上 缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造 成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方 法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间 内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
2 实验方法
一：材料
小鼠，生理盐水，100ml 灭菌烧杯，15ml 离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网， 泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养 液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳 培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃）， 液氮 罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
二：方法
（1）原代培养：
1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停 滴加不含血清的培养液冲洗。 5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入 10ml 培养液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。 面做好标志，注明细胞、组别及日期。然后将培养瓶置于二氧化碳培养箱中培养。
（2）传代培养：
1.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。
2.培养液瓶打开后，过酒精灯火焰，置酒精灯火焰周围。
3.拿出直头滴管，套上橡皮吸头，过火，放入培养液瓶中。
4.打开培养瓶，瓶口过火，将培养瓶内的培养液轻轻倒入废液缸，用 2-3mLPBS 洗去残留 的旧培养基。
5.培养瓶加入 0.25%胰酶，用量以薄薄盖满一层为宜，37℃消化，倒置显微镜下观察到细 胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，加入少量的含血清 的新鲜培养基。
6.取弯头滴管反复吹打细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培 养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于 CO2 气体的进入，将培养瓶放回 CO2 培养箱。
7.对半贴壁培养细胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
（3）冻存：
1.吸取传代后的细胞悬液，离心，去除培养液，加入冻存液，分装冻存管（冻存管内细胞数目一般为（5～10）×106 个/ml，2ml 冻存管中一般放 1～1.5ml 细胞）。
2.按步冻存
o 冷冻保存方法一：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可 增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
o 冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降 1～3℃至-80℃以下， 再放入液氮长期保存。
（4）复苏：
1.取出冷冻管，立即放入 37℃水浴箱中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化， 移入无菌操作台内。
2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
3.1000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液。
4.加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
3 实验结果计算
1.一只小鼠可获得（1～2.5）×108 个脾细胞。
2.细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5 天到一周即 可形成单层。
3.一般情况，传代后的细胞在 2 小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4 天就可在瓶内形成 单层，需要再次进行传代。
4 注意事项
1.取材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，注意不要损伤脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。
2.冲洗脾脏时要尽量洗净血污，去除无用组织，并要防止组织干燥。
3.碾磨后及时用清水冲洗筛网，防止组织、细胞阻塞网孔。
4.计数前，注意吸尽平皿里的细胞，充分混匀，使细胞分散成单个细胞。
5.实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。
6.金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成 组织损伤。
7.另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。
8.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再 用时会把有害物带入营养液中。
9.不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等所有可能与细胞接触的部分，如已 接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
10.开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。
11.换液时倾倒废液，瓶口不能接触废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。
12.吹打细胞时，要注意边角的细胞是否吹打下来。
13.手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上，即不可以在开放容器上方操作。
14.每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。
15.注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避 免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如 DMSO，并避免尖锐物品伤人等。
16.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液。
17.将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。
18.冻存和复苏最好用新配制的培养液。
薛差单658什么是细胞培养上清OD值 -
殷韩便17245838119 ______ 因为是诱导凋亡的实验,细胞加药处理后,贴壁细胞会因为活力丧失而脱壁漂浮,而这部分细胞正是你需要的,所以加药处理完后要收集全部培养上清,少量PBS洗瓶内剩下的细胞,洗的PBS与之前收集的上清合并.胰酶消化.消化完毕用之前收集的培养基中止消化.离心后PBS再洗一遍.离心,弃上清,细胞沉淀中加入70%4度预冷的乙醇(PBS配制),4度放置不少于1小时(有的文献说是不少于15分钟).之后离心去乙醇,PBS洗一遍后加入PI和DNAse,终浓度50ug/ml,混匀,避光室温放置30min后即可上流式细胞仪测定.
薛差单658PBST是什么?有什么作用? -
殷韩便17245838119 ______ 生物实验中提到的PBST是指PBS溶液加上Tween-20 PBS溶液是指磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution),渗透压近似于生理条件又有很强的pH缓冲能力,常用来洗细胞(不易涨裂)和作为细胞培养的基础液(pH缓冲). Tween-20为一种非离子表面活性剂,对细胞生长可产生影响. 不知你的是什么生化实验,根据物质基本性质和实验目的及步骤不难推测出其作用:)
薛差单658细胞培养中胰蛋白酶不去除,为什么不影响细胞贴壁 -
殷韩便17245838119 ______ 培养基中的血清会终止胰蛋白酶的活性.不过,胰酶实际上依旧会有影响,所以对于一些贴壁不牢的细胞系如293T,在传代的时候最好离心去掉胰酶,然后用PBS洗一下,细胞会长得好很多,否则传上几代以后,细胞贴壁就不太好了. 望对你有帮助!
薛差单658为什么要用PBS洗细胞多次啊 -
殷韩便17245838119 ______ 那要看你洗细胞干嘛了, PBS是磷酸缓冲液,可以使PH稳定在一定的范围,比如有些蛋白会在PH高了或者低了出现沉淀,所以需要PH保持稳定
薛差单658在动物细胞培养过程中,先后两次用胰蛋白酶,配制成细胞悬浮液,其作用分别是 -
殷韩便17245838119 ______ 第一次作用是洗掉原培养基吸附在细胞上的残留血清等物质,充当洗换液的作用,其实可以用其他溶液替代,比如PBS、hank`s、edta等,因为原培养基中残留血清会钝化胰酶,所以应当洗去;第二次用胰酶的的作用就是消化细胞,从而得以制得细胞悬液.
薛差单658细胞培养时用PBS冲洗细胞如何降低细胞损失 -
殷韩便17245838119 ______ 贴壁不牢的细胞 用移液管温和地将液体打在侧壁上~降低PBS冲洗时间及冲洗次数~
薛差单658细胞微纤丝的显示实验中pbs试剂的作用 -
殷韩便17245838119 ______ PBS主要是洗去细胞表面的杂志
薛差单658怎样培养与选择293细胞? -
殷韩便17245838119 ______ .293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖.哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养.这三种方式均可用于293细胞的大规模...
薛差单658生物学实验中病毒怎么保种和接种? -
殷韩便17245838119 ______[答案] 1.应该在细胞状态最好的时候,进行病毒接种或复苏; 2.接种前头天,进行细胞传代,细胞数量应以能让细胞在第二天内达到覆盖满90%的培养瓶为准,并且一定要在细胞传代后48h内接种病毒; 3.第二天细胞长为单层且状态较好时,开始接种病毒...
薛差单658细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗 -
殷韩便17245838119 ______ 细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好 一、贴壁细胞的消化 : 常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法.其中最常用的是酶消化法. 1、 酶消化法 贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式:1)、加入胰酶等干细胞...