给出一段序列怎么设计引物

1. 如何有效设计引物

（1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。

2. PCR电泳无扩增条带

（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

3. PCR产物量过少

（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。
（4）引物量不足。增加体系中引物含量。
（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

5. 扩增产物出现多条带（杂带）

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。

6. 阴性对照出现条带

（1）试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

7. 条带大小与理论不符

（1）污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
（2）模板或引物使用错误。查看引物是否会扩增部分条带和模板是否正确。
（3）基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

8. 持续出现假性条带

（1）起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的T值相差不大。可尝试适当提高PCR温度或者设置降落PCR，降低循环数。

9. 菌落PCR检测有条带，接种大摇后无条带

（1）可重新以菌落和菌液为模板进行PCR对照检测，因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高。如果仍出现上述结果，推测可能是平板上连接液中的未连接载体的扩增引起的目的条带，进一步质粒PCR检测，可证明目的片段是否真正连接成功。

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通蔡法722谁会熟练使用oligo设计引物啊,初学者请教大师 -
麻促坚19664331040 ______ 第一步:新建序列(或者通过Open直接打开序列) 第二步:确定你要设计引物的起始位点,双击下面的序列可以选中一段(暂时先不要管引物长度) 第三步:选择作为上游引物Select->Forward Primer,然后你会发现下面的序列上有...

通蔡法722如何设计引物 -
麻促坚19664331040 ______ 一般是通过设计软件,例如oligo6,primer5等,你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明,是比较容易的. 至于设计引物的一般原则如下: * 序列选取应在基因的保守区段 * 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免...

通蔡法722知道基因序列后,怎样找到编码蛋白的序列,接着怎么进行引物设计?求详细解答. -
麻促坚19664331040 ______ 1 NCBI--Sequence Analysis--ORF finder--将序列贴进去——OrfFinder 2 NCBI -- Primer-BLAST-- 将序列贴进去-- 设定参数 -- get primers 就可以拿到一些引物,然后比较筛选; 当然还可以到一些软件里去设计,如Primer 3等.

通蔡法722想用PCR扩增下面一段序列,从头到尾都要,PCR引物如何设计~~~ -
麻促坚19664331040 ______ 首先建议你学一下生物软件的应用,这对你有好处,因为早晚都要用. primer premier 5.0可以帮你 先到NCBI网站找到此序列所在基因片段,然后在用软件clustalx编辑,再用primer premier 5.0将你找到的基因片段paste,进行查找引物,太长时间没弄过了有点忘了,要不就帮你弄好了

通蔡法722pcr扩增中,如何设计引物? -
麻促坚19664331040 ______ 若是根据已知序列扩增未知物种的相应序列,可以根据先根据已知序列进行Blast搜索,发现其他同源序列,保存后进行比对,找出其中较保守区域,并根据Primer或Oligo等软件对某条序列进行分析,搜索其中适合做引物的片段,并人工修正不合适部分.也可以设计成兼并引物. 如果已经获得序列,只是需要设计引物将其中某段扩增出来,相对就简单些了,可以直接用上述软件进行设计就可以了. 当然,实际操作起来还要看运气啦.------更多交流,中国西部生命科学论坛

通蔡法722PCR引物,网上找到的是一小段DNA序列如图,那么上下游引物怎么设计呢? -
麻促坚19664331040 ______ 根据你找到的序列以及其他你所了解到的信息,到NCBI去找更长的序列.下载后再根据序列用primer 5等软件设计引物

通蔡法722请问PCR引物怎么设计 -
麻促坚19664331040 ______ 普通PCR规则: 1、18-25 bp;2、Tm值在45-60;3、2个引物之间没有超过5bp的互补序列;4、CG%在40-60%;5、避免连续出现3个以上的CCC或GGG;6、不要迷信百度.

通蔡法722高手帮我设计一下序列引物,我要PCR这整段序列: -
麻促坚19664331040 ______ 你没有告诉我最终要导入哪种受体细胞里,所以不知道给你选什么载体合适,也就没法给你酶切位点,因此默认给你连T载体.该片段是人类basigin的mRNA,因为你要的是全部片段,因此我设计引物的时候必须是最头尾部开始,这一对儿引物...

通蔡法722如何让设计引物 -
麻促坚19664331040 ______ 直接设计 只要包含了整个CDS区就可以

通蔡法722引物怎样设计才能包含所有的目的序列 -
麻促坚19664331040 ______ 1.在参数里指定产物/目的片段包含的区域,比如从哪个碱基开始多少个碱基2.或者在输入序列区,用[ ]将要扩增出来的序列标出来.这是网页版Primer3的处理方式,你可以参考一下