荧光定量pcr技术基本流程
一、PCR分子诊断技术
在全球医疗器械行业中，体外诊断是占比最高的细分领域之一，根据诊断原理的不同，体外诊断产品分为分子诊断、免疫诊断、生化诊断等多种类型。其中，分子诊断的灵敏度、特异性、准确性等均较为突出，尤其是在新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下，以PCR为代表的分子诊断技术得到了加速发展。
PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的英文缩写，是一种以DNA双链复制原理为基础，对特定核酸样本进行体外扩增的生物技术，能够将微量的核酸样本迅速拷贝至几百万倍，便于后续的分析研究。该技术源起于20世纪70、80年代，经过几十年的发展，经历了初代传统PCR、第二代荧光定量PCR和第三代数字PCR的演变，在医疗筛查诊断、生命科学基础研究、法医分析鉴定及食品卫生和环境检测等方面得到广泛应用。
1.荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，简称qPCR，是在PCR反应体系中加入荧光物质（荧光染料或荧光标记的特异性探针），利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
与普通PCR相比，实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃。运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、定量和定性分析。
（图：荧光定量PCR实验过程）
2.数字PCR
数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。PCR实际上是一个在模板DNA、引物（模板片段两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。
（图：数字PCR技术原理）
根据微反应单元的不同形式，数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。目前，市场上主要的数字PCR产品主要是基于微滴式和芯片式。
三代核酸检测技术对比：
技术方法 | 概念 | 技术优势 | 技术劣势 |
传统PCR | 采用普通PCR扩增仪扩增靶基因，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析 | 1.可实现特定核酸片段的体外复制 | 1.相关核酸染料对操作人员和环境具有危害 2.易出现假阳性结果 3.耗时时间长、操作复杂 4.无法准确定量 |
荧光定量PCR | 是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。 | 1.污染风险低 2.操作流程更简单、经济高效 3.样品加样量少 | 1.不同厂家生产的试剂和设备之间的差异对检测结果影响较大，不具备可比性 2.存在背景值的影响，结果易产生偏差 3.低拷贝的DNA难以检测 4.受PCR抑制物的影响较大 |
数字PCR | 将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元（纳升级）中，部分反应单元包含靶标分子（阳性），而其他不包含（阴性），接着进行扩增，并利用TaqMan化学试剂或染料标记探针检测靶标序列，能够实现靶标分子的绝对计数。 | 1.特异性强、灵敏度高 2.绝对定量，准确性好 3.抗干扰能力强 | 1.仪器设备和试剂昂贵、操作复杂 2.检测时间长、成本较高、检测范围较窄 |
二、光学原理解决方案
1.荧光定量PCR
（图：荧光定量PCR光路图）
（图：荧光定量PCR光谱）
2.数字PCR
（图：数字PCR光谱）
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