转染换液

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调 pH），氨苄青霉素，卡那 霉素，质粒提取试剂盒 

仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒 1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：

1.  LB 培养基的配制：

在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇 动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 15psi 高 压下蒸汽灭菌 20min.

固态培养基

LB 固体培养基及倒板 ：

（1）.配制：100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉

（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55℃的水浴中，待培 养基温度降到 55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为 50μg/ml），以免温度过 高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于 4℃保存，一个月内使用。

2.  从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

3.  加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30分钟后。

4.  42℃水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。

5. 向管中加入 1ml LB 液体培养基（不含 Amp），混匀后 37℃振荡培养 1 小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。

6. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌 液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养 16-24 小时。

同时做两个对照：

对照组 1： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情 况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

对照组 2： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不 含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

大肠杆菌的扩增

1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3-5ml LB 液体培养基中，37℃下振荡 培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1：100-1：50 的比例接种 于 100ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 ＝0.5 左右。

2.  取上述培养液置于冰中 10min，之后转移到已灭菌的 50ml 离心管中再于冰上放置5min

3.  于 4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌

4.   质粒的提取

准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

5.   质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）

质粒转染细胞株

材料

细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA 消化液、转染试剂（Lipofectamine  TM2000）

实验步骤

Ⅰ.准备细胞：

贴壁细胞：转染前 24 h，在 500 µL 无双抗完全培养基中接种 0.5-2×105 个细胞， 转染时细胞融合度为 80 - 90% 。 ( 注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞 堆积生长。)

II  ．对于每个转染样品，按下面的方法准备：

（1）用 50 µL Opti-MEM 稀释 0.8 µg 质粒 DNA，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下 静置 5 min。

（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 µL Opti-MEM  稀释 2.0 µL   LipofectamineTM2000，轻轻吹吸 3 - 5  次混匀，室温下静置 5  min。

（3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100  µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5）将细胞板置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右。 稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）

从 37℃，5％CO2 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 µg/ml G418 的 新鲜培养基，每  2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到 60%汇合率时再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选一次。当细胞达到 90%以上汇合率时将细 胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10-12 天左右）。以后每隔 4-5 天再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染 后 15 天左右）。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

那娇度3002贴壁细胞传代是否一定要消化后离心呢 -
崔科使13132897713 ______ 可以传代. 转染分2种,一种是瞬时转染,即转染后让细胞表达目的蛋白后即提取蛋白,提一次蛋白,转染一次,这种方式一般不传代; 另一种转染为稳定转染,转染后加入一定选择压力进行筛选,没有转染的细胞不能存活,只留下转染的细胞,这种情况下可以筛选单个转染细胞,构建稳定表达某一特定蛋白或基因的细胞系.

那娇度3002质粒转染细胞 细菌污染 为什么 -
崔科使13132897713 ______ 一般质粒提取最后的时候注意一下,用灭菌水和无菌的EP管,管口过火,质粒提取后如果要检样,用无菌枪头.转染完成之后,换培养液的时候要加双抗的培养液. 注意这些一般不会有问题.

那娇度3002dna用乙醇沉淀后可以用于细胞转染吗 -
崔科使13132897713 ______ 可能有多种原因: 目标蛋白对细胞有毒性,导致细胞死亡; 转染试剂以及DNA用量信息需要优化,否则对细胞具有伤害; 细胞贴壁转染之后没有正常换液. 建议: 考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统; 摸索转染试剂以及DNA用量信息,如果转染试剂毒性太大,可以考虑尝试义翘转染试剂sinofection; 对转染后的细胞进行换液处理,如果细胞状态感觉不够理想,可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康. 以上所有分析、建议的前提是,细胞培养、无菌操作等等都没有问题.祝顺利,加油~

那娇度3002lipofectamine 2000脂质体转染 -
崔科使13132897713 ______ 博凌科为生物科技-为你解答:这应该是一种贴壁细胞,先按说明书提供的比例计算要用的lipofectamine 2000和DNA的量,分别用无血清培养液稀释lipofectamine 2000和要转染的DNA,按说明书要求的时间混合两种稀释液,在等待的时间里用无血清培养液洗2两遍细胞,加入适量的无血清培养液,再将lipofectamine 2000和DNA的混合液加入培养板或培养瓶,放细胞培养箱就行了,过4~6小时换含血清的培养液.洗细胞和加液的时候动作要轻.

那娇度3002请问HEK293细胞如何将质粒转染进去,有没有具体的步骤?我有lipo2000 -
崔科使13132897713 ______ 看看lipo的说明书不就知道啦 以6孔板的一个孔为例吧 一管200ul OPTI+5ul lipo 静置5分钟 另一管200ul OPTI+4mg质粒 两管混匀静置20分钟后加到一个孔里 4-6小时后换液

那娇度3002细菌与真核细胞的转染有何异同? -
崔科使13132897713 ______ 准确来说,细菌叫“转化”,真核细胞叫“转染”. 转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”.其中,核酸包括DNA(质粒和线性双链DNA),反义寡核苷酸及RNAi(RNA interference).基因...

那娇度3002细胞换液是否需要用PBS清洗? -
崔科使13132897713 ______[答案] 那就要看实验要求严不严了. 需要将细胞用作他途,比如拿去做转染、提蛋白等,这就需要将细胞用PBS清洗,但也不是必须,得看情况.一般细胞换液,可以不用PBS清洗.

那娇度3002什么是基因转染 -
崔科使13132897713 ______ 基因转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”.其中,核酸包括DNA(质粒和线性双链DNA),反义寡核苷酸及RNAi(RNA interference).基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究(基因表...

那娇度3002细胞长满了可以转染吗 -
崔科使13132897713 ______ 不能,接触抑制

那娇度3002细胞换液是否需要用PBS清洗? -
崔科使13132897713 ______ 那就要看实验要求严不严了. 需要将细胞用作他途,比如拿去做转染、提蛋白等,这就需要将细胞用PBS清洗,但也不是必须,得看情况.一般细胞换液,可以不用PBS清洗.