酚试剂法测蛋白质注意事项
本实验室应用的Folin-酚试剂为北京某某昌盛生物技术有限公司生产，效果尚可，该公司生产的BCA蛋白定量试剂盒比Folin-酚试剂检测更精确，且不受绝大部分样品中的化学物质的影响，对于蛋白纯化样本含量测定来说更加适合。
1、Folin-酚法（Lowry法）原理：
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
2、技术指标：
本试剂盒可测定蛋白浓度0.05--1mg/ml。当蛋白浓度范围在0.05-0.5mg/ml范围时，线性关系最好。标准曲线相关系数：R2大于0.99.
3、试剂盒组分：
1.Folin—酚试剂甲
溶液I：2g无水碳酸钠和20mg酒石酸钠溶于100ml 0.2mol/l氢氧化钠中（已配制成5×，用时稀释5倍，使用完需另配)。
溶液Ⅱ：0.5g五水硫酸铜溶于100ml水溶液。
将稀释后的溶液I与溶液Ⅱ，以50：1的比例混合，混合后即为Folin—酚试剂甲，此试剂只能用一天，过期失效。
2.Folin—酚试剂乙
原液浓度为2moL/L使用前需稀释一倍，用多少稀释多少。使其最后浓度为1moL/L。此为Folin—酚试剂乙应用液。Folin—酚试剂乙原液平时应密封贮存于4℃冰箱中避光保存。
4、操作方法：
标准曲线的制作
取14支试管分成两组，按下表顺序加入试剂，混匀，于室温放置10分钟。再加入0.5毫升试剂乙，立即摇匀，在室温放置30分钟，然后于500nm处比色。测定光密度值。取两组测定的平均值，以蛋白质浓度为横座标，光密度值为纵座标，绘制标准曲线为定量的依据。
试剂/管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
BSA/ml(250ug/ml | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水/ml | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
试剂甲/ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
试剂乙/ml | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
样品测定：
（1）取1毫升样品溶液（约含20-250微克多肽或蛋白质）加入5毫升试剂甲混匀，于室温放置10分钟。
（2）加入0.5毫升试剂乙（folin—酚），立即摇匀，于室温保温30分钟；然后500nm（根据使用情况）处比色，以1毫升水代替样品作空白对照。测定后，可以从标准曲线中查出未知样品浓度。
若用0.5厘米光程的比色杯进行比色，可按下面方法进行操作：取0.2毫升样品溶液（约含5-100微克多肽或蛋白质），加入1毫升试剂甲（可选用0.3-0.5厘米直径的小试管）混匀，10分钟以后，再加入0.1毫升试剂乙，立即混匀，30分钟后比色，一般来说，若多肽或蛋白质浓度在2-25微克，则采用波长755nm,而25微克以上则采用500nm比色为宜（波长选择依使用情况）。
样本1 | 样本2 | 样本3 | ||||||||
试剂/管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
BSA/ml(250ug/ml)或样本 | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
蒸馏水/ml | 0.2 | 0.18 | 0.16 | 0.12 | 0.08 | 0.04 | 0 | 0 | 0 | 0 |
试剂甲/ml | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
试剂乙/ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
测值1 | ||||||||||
测值2 | ||||||||||
计算Pr= | ||||||||||
紫外分光光度计测Pr= |
500nm波长
广恒差5128测定可溶性蛋白用福林酚法还是考马斯亮蓝 -
成帘敬18187693947 ______[答案] 植物体内可溶性蛋白质含量的测定(福林-酚法的原理)点击次数:901 作者:佚名 发表于:2009-04-30 00:00 转载请注明来自丁香园 来源:西昌大学 该方法是双缩脲法的发展,包括两步反应: (1)在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜...
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广恒差5128蛋白质含量的测定都有哪几种方法,适用情况以及优缺点 -
成帘敬18187693947 ______ ①凯氏定氮法 原理:蛋白质平均含氮量为16%.当样品与浓硫酸共热,蛋白氮转化为铵盐,在强碱性条件下将氨蒸出,用加有指示剂的硼酸吸收,最后用标准酸滴定硼酸,通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量. ②双缩脲...
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广恒差5128如何使用Folin - 酚法测定蛋白酶的活力? -
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广恒差5128酚顿试剂配制方法 -
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成帘敬18187693947 ______ 注意事项:(1)消化前加硫酸是应将附着在瓶壁上的粉末仔细冲洗至瓶中,消化 过程中应注意转动烧瓶,利用冷凝的酸液将附着在瓶壁上的炭粒冲下,以促迚消化; (2)消化必须在通风橱中迚行,消化开始时文火加热,以克液体窜出.消化时如果采用 直接火加热,火焰丌能超过液面以上,否则可能引起烧瓶爆裂;(3)样品消化液丌易 澄清透明时,可将烧瓶完全冷却后加入30%过氧化氢2~3mol 后继续消化,直至消化 液澄清透明呈蓝绿色为止. 消化过程中的颜色发化: 样品无色(加硫酸前)→加硫酸炭化黑色→消化后红棕色→棕褐色→消化终点蓝绿色/ 墨绿色→淡蓝色(冷却后溶液)
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成帘敬18187693947 ______[答案] 超速离心:既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量. 含量测定方法很多: 凯氏定氮:灵敏度低,适用于0.1.0mg氮,误差为 ±2%,干扰少,费时8小时 双缩脲法(Biuret法):灵敏度低1~20mg,中速20~30分钟 紫外吸收法:较为...
广恒差5128Folin - 酚测定蛋白质含量实验对标准蛋白质的材料有什么要求?? -
成帘敬18187693947 ______ 没有特别的要求,这个方法的原理是试剂和蛋白质中酪氨酸、苯丙氨酸残基反应显色,蛋白只要能溶于水形成均匀澄清溶液,不会影响显色,就可以了.
广恒差5128检验蛋白质的方法 -
成帘敬18187693947 ______ 用蜡烛点燃,可以闻到有特殊的焦丑味,就说明有蛋白质的成分.