酚试剂法
本实验室应用的Folin-酚试剂为北京某某昌盛生物技术有限公司生产，效果尚可，该公司生产的BCA蛋白定量试剂盒比Folin-酚试剂检测更精确，且不受绝大部分样品中的化学物质的影响，对于蛋白纯化样本含量测定来说更加适合。
1、Folin-酚法（Lowry法）原理：
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
2、技术指标：
本试剂盒可测定蛋白浓度0.05--1mg/ml。当蛋白浓度范围在0.05-0.5mg/ml范围时，线性关系最好。标准曲线相关系数：R2大于0.99.
3、试剂盒组分：
1.Folin—酚试剂甲
溶液I：2g无水碳酸钠和20mg酒石酸钠溶于100ml 0.2mol/l氢氧化钠中（已配制成5×，用时稀释5倍，使用完需另配)。
溶液Ⅱ：0.5g五水硫酸铜溶于100ml水溶液。
将稀释后的溶液I与溶液Ⅱ，以50：1的比例混合，混合后即为Folin—酚试剂甲，此试剂只能用一天，过期失效。
2.Folin—酚试剂乙
原液浓度为2moL/L使用前需稀释一倍，用多少稀释多少。使其最后浓度为1moL/L。此为Folin—酚试剂乙应用液。Folin—酚试剂乙原液平时应密封贮存于4℃冰箱中避光保存。
4、操作方法：
标准曲线的制作
取14支试管分成两组，按下表顺序加入试剂，混匀，于室温放置10分钟。再加入0.5毫升试剂乙，立即摇匀，在室温放置30分钟，然后于500nm处比色。测定光密度值。取两组测定的平均值，以蛋白质浓度为横座标，光密度值为纵座标，绘制标准曲线为定量的依据。
试剂/管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
BSA/ml(250ug/ml | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水/ml | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
试剂甲/ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
试剂乙/ml | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
样品测定：
（1）取1毫升样品溶液（约含20-250微克多肽或蛋白质）加入5毫升试剂甲混匀，于室温放置10分钟。
（2）加入0.5毫升试剂乙（folin—酚），立即摇匀，于室温保温30分钟；然后500nm（根据使用情况）处比色，以1毫升水代替样品作空白对照。测定后，可以从标准曲线中查出未知样品浓度。
若用0.5厘米光程的比色杯进行比色，可按下面方法进行操作：取0.2毫升样品溶液（约含5-100微克多肽或蛋白质），加入1毫升试剂甲（可选用0.3-0.5厘米直径的小试管）混匀，10分钟以后，再加入0.1毫升试剂乙，立即混匀，30分钟后比色，一般来说，若多肽或蛋白质浓度在2-25微克，则采用波长755nm,而25微克以上则采用500nm比色为宜（波长选择依使用情况）。
样本1 | 样本2 | 样本3 | ||||||||
试剂/管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
BSA/ml(250ug/ml)或样本 | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
蒸馏水/ml | 0.2 | 0.18 | 0.16 | 0.12 | 0.08 | 0.04 | 0 | 0 | 0 | 0 |
试剂甲/ml | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
试剂乙/ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
测值1 | ||||||||||
测值2 | ||||||||||
计算Pr= | ||||||||||
紫外分光光度计测Pr= |
500nm波长
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