6cm培养皿加多少裂解液

一、原理：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用 的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体 内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原 达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一 种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白 的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态 的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质 相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作 用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不 正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：

预冷 PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机

1. 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干 PBS；

2. 加入预冷的 RIPA Buffer(1ml/107 个细胞、10cm 培养皿或 150cm2 培养瓶，0.5ml/5×106 个细胞、6cm 培养皿、75cm2 培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中，4℃， 缓慢晃动 15min（EP 管插冰上，置水平摇床上）

4. 4℃，14000g 离心 15min，立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备 Protein A agarose，用 PBS 洗两遍珠子，然后用 PBS 配制成 50%浓度，建 议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每 1ml 总蛋白中加入 100μl Protein A 琼脂糖珠（50%），4℃摇晃 10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景

7. 4℃，14000g 离心 15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除 Protein A 珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1：10 倍 以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）

9. 用 PBS 将总蛋白稀释到约 1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如 10 μg/μl）

10. 加入一定体积的兔抗到 500μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞 系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2 h 室温孵育

12. 加入 100μl Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠 IgG，兔抗鸡 IgG）

13. 14000rpm 瞬时离心 5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的 RIPA buffer 洗 3 遍，800μl/遍，RIPA buffer 有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内 部的结合，可以使用 PBS

14. 用 60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量 依据上样多少的需要而定（60 μl 足够上三道）

15. 将上样样品煮 5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余 琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮 5min 变性。

RIPA Buffer 配制：

基础成分：

Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）

 NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%储存液）

去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%储存液；避光保存）

注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA 蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成 200mM 的储存液，室温保存）

EDTA（钙螯合剂；用 H2O 配制成 100mM 的储存液，PH 7.4）

亮抑酶肽（Leupeptin）（用 H2O 配制成 1mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用 H2O 配制成 1mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成 1mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

RIPA 磷酸（酯）酶抑制剂

激活的 Na3VO4（用 H2O 配制成 200mM 的储存液，见 Sodium Orthovanadate Activation Protoco）

NaF（200mM 的储存液，室温保存）

莫茜昭5023一只圆柱形水杯,内直径为6厘米,杯内装水10厘米,恰好是杯子容积的60%,杯内还可以加入多少毫升的水. -
阚莉世19669138920 ______[答案] 还可以=3*3*3.14*10÷60%*(1-60%)=188.4毫升

莫茜昭5023一只圆柱水杯,内直径6CM,水深8CM,占杯子容积三分之二,杯内需加多少毫升水? -
阚莉世19669138920 ______ 半径是6÷2=3厘米 水的体积是3*3*3.14*8=226.08立方厘米=226.08毫升 杯子的容积是226.08÷3分之2=339.12毫升

莫茜昭5023一只圆柱形水杯,内直径为6厘米,杯内装水10厘米高,恰好是杯子容积的60%,杯内还可以加入多少毫升水 -
阚莉世19669138920 ______[答案] 内半径=3厘米 10÷60%-10=3分之20 厘米 还可以加水 =3.14*3*3*3分之20 =188.4立方厘米 =188.4毫升

莫茜昭5023一个底面直径6cm的杯子里装有一些水,水面具水杯底4cm加入一点水后,水面上升了10厘米加入了多少水? -
阚莉世19669138920 ______[答案] 3.14X3X3X10=28.26立方厘米

莫茜昭5023造血干细胞集落计数请教各位这些小黑点和小亮点是什么?黑点不会动,?
阚莉世19669138920 ______ 黑色的是污染源 白色的是细胞碎片 而且因为污染源导致的 细胞的感染所以黑点不会动 这个如果细胞达到100亿需要加快他的生长需要生长液 (为您解答,希望帮到您,如有用,请选下方“对我有用”谢谢采纳.)

莫茜昭5023长6厘米,高3.5厘米,宽4厘米,求体积表面积 -
阚莉世19669138920 ______ 体积6*4*3.5=84立方厘米 表面积(6*4+3.5*4+6*3.5)*2=118平方厘米

莫茜昭5023有一个盛有水的正方体容器,放入一个棱长6厘米的正方体铁块完全浸没水面上升2厘米取出铁块放入一个底面积是是54平方厘米的长方体铁块也完全浸没水面... -
阚莉世19669138920 ______[答案] 两种铁块依次没入水中,都是水面升高相同的高度.说明两铁块体积一样.棱长6厘米的正方体铁块体积为:6*6*6=36*6=216(立方厘米)设底面积为54平方厘米的长方体铁块高为h,则54h=216h=216/54=4(厘米)答:长方体铁块的高是4...

莫茜昭5023红墨水中的染料一实验:1.取一支粉笔,在距离粗的一头1厘米处点上一点红墨水,点完后红墨水的直径约为1毫米2.在培养皿里加酒精作为展开液,液面高... -
阚莉世19669138920 ______[答案] 一 现象肯定是墨水点变大了 二 1 水红色没了,变成无色的了 2能

莫茜昭5023一个长方体的玻璃缸,长、宽、高分别为18厘米 12厘米 20厘米 缸中水高10厘米.把一个棱长6厘米的正方体铁放入缸中,缸中的水升高多少厘米? -
阚莉世19669138920 ______[答案] 棱长是6厘米的正方体的体积等于6*6*6=216立方厘米 玻璃缸的底面积是18*12=216平方厘米 水升高的高度是:216÷216=1厘米,水升高到10+1=11厘米