dmso溶解药物后需要过滤吗

一、原理

噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜

（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数 量。

二、试剂材料准备与实验仪器

1）对数生长期细胞

2）受试因素（药物）

3）MTT：以 PBS 配制成 5mg /ml，抽滤除菌，保存在 4˚C

4）DMSO（二甲基亚砜）

5）96 孔板

6）酶联免疫检测仪

7）细胞培养箱

三、实验步骤（适用于贴壁细胞）

1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。

2）置 37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁。

3）加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml 的药物，时间依 据实验需要，一般 3 天。

4）小心吸去上清，PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

5）每孔加入 180 ul 新鲜 RPMI 1640 培养液，再加入 20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即

0.5%MTT），继续培养 4 h。

6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。

7）每孔加入 150 ul 二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS 代替），置摇床上低速 振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。 8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解 介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。

三、结果统计学处理

所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p<0.05 时为相差显著，p<0.01 时 为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求 IC50。 或计算抑制率。

四、注意事项与常见问题 

1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照 孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质， 而加药组加入不同浓度的药物。

 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降 低，太少观察不到差异。

3）贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为20ul/孔。

4）如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 ml，MTT 按照 10%的比例加入。

5）MTT 一般 4 度保存两周，注意避光保存，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存， 避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后 可过滤一下。

6）对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm 有最大吸收值；而对于 SDS 和酸化异丙醇，

则选用 570nm，并且建议以 655nm 作为参考波长。

7）96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分 蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保 证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。 

8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每 接几个就要再混匀一下。

9）没有去掉上清直接加 DMSO，沉淀会很难溶解。加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液 里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心 96 孔板，2000r，5 分钟， 然后吸掉上清。加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。 

10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。

11）除置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶。 

12）关于如何计算 IC50 方法有多种 

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) 

(2)Bliss 法:自己查阅书籍

(3) IC50 计算软件，见下面附件（暂时找不到了）

(4)自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50，关于 LD50 的方法与此相似！

(5)在线求 IC50 或 EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm 13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.

关剂杰2781dmso能长时间存放在离心管中吗 -
申俘卿15360661589 ______ 不会.ep管 离心管 等试验用耗材都是多聚物的 很稳定.我们做核磁氢谱碳谱时用DMSO在EP管里溶解样品,在转移到核磁管中去测试,没有任何干扰信号.这都是纯DMSO呢,你溶解药品再稀释,就更不会有事了.做细胞培养也都是用DMSO,也接触到了同样材质的一次性耗材,也对细胞没有影响.况且,药理实验中允许DMSO溶解再用溶媒稀释药品,对实验结果没有影响的,放心吧.

关剂杰2781药物制剂技术——处方分析 -
申俘卿15360661589 ______ 我尽量回答您的问题,让您满意: 1.处方分析 硝酸咪康唑溶液处方 从上面处方来看,应该是外用制剂: 硝酸米康唑--主药 二甲亚DMSO--溶剂,兼有一定促进剂作用 森林果香精--矫味剂中的芳香剂 乙醇-------溶剂 (分析:硝酸米康唑极微溶于...

关剂杰2781细胞培养时,乙酰唑胺用什么溶液配制?
申俘卿15360661589 ______ 乙酰唑胺我没有配过,但是配制细胞刺激药物时一般是水溶性药物用PBS配制,不溶于PBS的先用DMSO溶解,然后用PBS或无血清培养基稀释.DMSO的浓度不能太高,否则会对细胞有影响.

关剂杰2781用DMSO溶解的药物如果加入细胞培养液中进行干预后析出,实验结果有意义么? -
申俘卿15360661589 ______ 加完dmso之后mtt并不会很快溶解,需要震荡加速溶解,时间不定. 那你需要确定物的浓度是否过大、物溶解性、是否可能与mtt有反应等潜在的原因.

关剂杰2781dmso稀释药物浓度太低对细胞不起作用怎么办 -
申俘卿15360661589 ______ 看药品说明,datasheet上面会有相关的 DMSO溶解指数 ,尽可能少放DMSO 用DMSO稀释之后,再用培养基逐渐扩大稀释倍数. 刚开始做,可以参照相关文献,基本都会给出IC50的相关信息,根据这个做一个大的浓度梯度范围,然后再慢慢缩小范围 e.g. IC50 是 10 μM. 你可以做 0. 1 5 10 20 40 80 100这样一个梯度范围. DMSO最终浓度建议小于0.1%.大于0.1的话要做DMSO参照.不加药物,只加与实验组等量的DMSO,排除DMSO对实验的影响. 相关的药物试验,建议多读文献,不要盲目的去做.

关剂杰2781试验药物不能溶解于水怎么办?
申俘卿15360661589 ______ 不溶于水或难溶于水的药物可用二甲亚砜(DMSO)、乙醇、聚乙二醇、羧甲基 纤维素等非水溶剂进行溶解,但具体应选择哪一种应根据厂家提供的资料做决定对用非 7JC溶剂溶解的药物应配制高于100倍的测试浓度,而且由高浓度到低浓度的稀释也应用同 样的溶剂,溶剂的终浓度必须低于1 %.

关剂杰2781细胞冻存液中的DMSO是否要求无菌 -
申俘卿15360661589 ______ 要的,虽然没有已知的物种会在纯的DMSO里面生长,但是如果没有经过灭菌处理,难保没有孢子什么的 可以把纯DMSO高压灭菌,或者在配置好冻存液以后用0.22微米的膜过滤 如果想要直接过滤纯DMSO,要用nylon membrane filters,否则有的膜会被DMSO溶解

关剂杰2781dmso的浓度为多少时不需做溶剂校正 -
申俘卿15360661589 ______ 你好,DMSO是一种细胞保护剂,它的作用机理是在细胞膜上打洞,使细胞内的水分子能渗透出来,从而防治冷冻细胞时,细胞内冰晶的形成,而破坏细胞.所以在做细胞冻存时它是必不可少的,但DMSO又能损伤细胞使用它时需要有一定浓度,一般采用的是终浓度10%就行了.最大浓度药物的DMSO含量是0一般来说,培养基中浓度为小于0.5%就可以了,但据实验观察小于0.25%肯定没有问题.相关要求不超过1%祝你健康

关剂杰2781中医药科研设计中药物的剂量有何要求?
申俘卿15360661589 ______ 在中药研究中涉及一个最具体的问题就是药物的剂量.刚才赵老师也谈到临床研究中涉及药物的剂量.他提到的那个研究者设计的三个剂量在医学家基础研究中倒 是比较常...

关剂杰2781求助DMSO作为药物溶剂的终浓度 -
申俘卿15360661589 ______ 可以适当再加一点DMSO,控制好最终浓度,因为DMSO一般在千分之五一下对细胞毒性就很小了.