dna电泳结果图怎么看

实验目的

琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

实验原理

   琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品其中有三种构型的分子共价闭合环状的超螺旋分子cccDNA、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA

    核酸分子是两性解离分子pH3.5是碱基上的氨基解离而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离所以分子带正电在电场中向负极泳动而pH8.0-8.3时碱基几乎不解离而磷酸基团解离所以核酸分子带负电在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言电荷密度愈大泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说分子量的常用对数与泳动率成反比用此标准样品电泳并测定其泳动率然后进行DNA分子长度bp的负对数——泳动距离作标准曲线图可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大比如质粒分子泳动率的大小顺序为cDNAIDNAocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响会出现相反的情况。

2、支持物介质

核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺Acr在N,N,N′-四甲基乙四胺TEMED和过硫酸铵AP的催化下聚合形成长链并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺Bis交叉连接而成其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。

琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段5bp-500bp的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA分子。

3、电场强度

电场强度愈大带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小所以电泳时一般采用低电压不超过4V/cm。而对于大片段电泳甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

4、缓冲液离子强度

核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统但它们各有利弊。TAE价格低廉但缓冲能力低必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时会使DNA污染磷酸盐影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。

在缓冲液中加入EDTA可以鳌合二价离子抑制DNase保护DNA。

缓冲液pH常偏碱性或中性此时核酸分子带负电向正极移动。

核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭ethidium bromide EB。溴化乙锭是一种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时出现不同的效应。254nm的紫外线照射时灵敏度最高但对DNA损伤严重360nm紫外线照射时虽然灵敏度较低但对DNA损伤小所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高且对DNA损伤不是很大所以也比较适用。

使用溴化乙锭对DNA样品进行染色可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况但是如果要测定核酸分子大小时不宜使用以上方法而是应该在电泳结束后把凝胶浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中1030min进行染色。BE见光分解应在避光条件下4℃保存。

材料、试剂及器具

1、材料

1kbMarker分子量标准DNA样品

2、试剂

加样缓冲液6x0.25%溴酚兰40%蔗糖琼脂糖溴化乙锭EB酶液10mg/ml。

3、器具

1电泳系统电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。

2紫外透射仪。

操作步骤

1、按所分离的DNA分子的大小范围称取适量的琼脂糖粉末放到一锥形瓶中加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化溶液透明。稍摇匀得胶液。冷却至60℃左右在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。 

2、取有机玻璃制胶板槽有透明胶带沿胶槽四周封严并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。

3、水平放置胶槽在一端插好梳子在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液使之形成均匀水平的胶面。

4、.待胶凝固后小心拔起梳子撕下透明胶带使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

5、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖过胶面

6、把待检测的样品按以下量在洁净载玻片上小心混匀用移液枪加至凝胶的加样孔中。

1μl加样缓冲液6×+5μl待测DNA样品

〔+0.5μlEB液10mg/ml注若胶内未加EB可选用此法。〕

7、接通电泳仪和电泳槽并接通电源调节稳压输出电压最高不超过5V/cm开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

8、观察溴酚兰的带蓝色的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处可停止电泳。

9、染色把胶槽取出小心滑出胶块水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上放进EB溶液中进行染色完全浸泡约30min。

10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜赶去气泡平铺然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门打开紫外灯360nm或254nm通过观察孔进行观察。

注意事项

1、电泳中使用的溴化乙锭EB为中度毒性、强致癌性物质务必小心勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作戴一次性手套并及时更换。

2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB染色步骤可省略若凝胶放置一段时间后才观察即使原来胶内或样品已加EB也建议增加此步。

3、加样进胶时不要形成气泡需在凝胶液未凝固之前及时清除否则需重新制胶。

4、以0.5×TBE作为电泳缓冲液时溴酚兰在0.5%1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度而二甲苯青FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。

蓝琰鱼1161如何分析PCR扩增后的电泳图? -
澹剑庭18832066816 ______ 在电泳的时候加上DNA的分子量marker,一般16S的大小都是1.5 kb吧(很久不做了,记不太清楚).如果有明显的目的条带而且大小也合适的话那就一般不会错,如果想要确定,可以将条带从胶中切下来,回收之后送去测序,就可以知道序列的详细信息了. 另外你的目的如果只是判断DNA的提取是否成功的话,那么在提取DNA之后直接跑电泳就可以了,没有必要做PCR扩增16S.一般细菌基因组都在15~16k大小左右.

蓝琰鱼1161未知基因组DNA提纯后pcr扩增,出现的电泳应该是什么样的怎样分析呢.如图.怎样判断对错呢?比如说第6道? -
澹剑庭18832066816 ______ 你的问题不明确.首先你要给出PCR的引物,说明这对引物是扩增什么基因的,这个目的基因的长度,然后通过电泳条带与两边的marker比较,推算出其长度,如果符合你需要扩增的基因的长度,就可以认为是正确的了.从电泳图谱上可以看出,扩增的条带大于1kbp,选取的DNA marker小了,这样判断扩增产物的大小不够精确.

蓝琰鱼1161如何分析琼脂糖凝胶电泳检测DNA的图谱? -
澹剑庭18832066816 ______ 不同DNA有自己相应的条带,比如基因组DNA是一条,质粒一般是2条.而不同大小的DNA有不同位置,越靠前的电泳速度快说明size小,和ladder比较就可以判断自己DNA大小.注意这些就可以

蓝琰鱼1161基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果达到何种程度算质量好 -
澹剑庭18832066816 ______ 基因组DNA条带很大,并且由于提取基因组DNA的过程中,会或多或少的断裂,所以一般会有拖带现象的.好一点的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳在上样孔附近有很亮的条带,并且比较宽,感觉就是有点拖带.还有就是最下端没有RNA条带,如果有的话就要用DNase消化.楼上的图只是普通的DNA电泳图,并不是基因组的电泳图.

蓝琰鱼1161下面这个DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果怎么分析 -
澹剑庭18832066816 ______ 看来这时指核小体被酶切后的电泳图咯,效果有点差哦! 1、4是Marker,2 是染色质,3是小球菌核酶(micro coccal nuclease)处理的染色质. 现象描述:在约200-1000bp有明显的梯度带(每带隔约200bp), 这时因为用一种能使DNA降解的...

蓝琰鱼1161DNA酶切以及电泳的结果应如何分析 -
澹剑庭18832066816 ______[答案] 你切完之后不点Marker的吗?根据marker你可以判断你的条带大小啊!我们这边用的DNA MARKER III 从上到下条带大小分别为4500bp 3000bp 2000bp 1200bp 800bp 500bp 300bp 100bp.然后你 就可以估算出大小了啊.如果你只是...

蓝琰鱼1161怎样通过凝胶电泳图谱检测DNA的纯度和浓度 -
澹剑庭18832066816 ______ 这个应该用分光光度计检测啊,浓度看OD260,纯度看OD260/OD280以及OD260/OD230. 要是非用电泳检测,纯度就看看点样孔是否发亮,发亮的话是有蛋白质,浓度的话可以在旁边加一个已知浓度的marker.

蓝琰鱼1161质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图分析 -
澹剑庭18832066816 ______ 原因很多啦,要么就是你上的样中没有目标条带的DNA啊,变形么就是你做的胶不怎么好啊或者上样液没处理好啊电流控制啊,很多问题的

蓝琰鱼1161琼脂糖凝胶电泳结果怎么看 -
澹剑庭18832066816 ______[答案] 首先要看有没有M对照,然后观察在同一泳道上共有几条 亮带,分别标记a b c,泳道也要标记123456等序号,以方便分析,最后要看你提取的是什么,一般做实验是提取DNA,可以分析它的分子大小,若在实验中没有加入RNase,可能在最下端出...

蓝琰鱼1161DNA酶切反应不彻底电泳图谱是怎样的?DNA若发生降解,酶切图谱又是怎样的 -
澹剑庭18832066816 ______[答案] DNA酶切反应不彻底电泳图谱会产生额外的条带,比如本来一个大片段彻底切开后可以产生3个小片段.如果不彻底切开,那电泳的时候就会又有大片段,又有两两组合的中等判断,也会有3个小片段. 如果发生降解,条带就会变得模糊,没有降解的部...