qrtpcr结果分析

今天小编和大家分享一篇于2023年11月发表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志上的文章MYL9 expressed in cancer‑associated fibroblasts regulate the immune microenvironment of colorectal cancer and promotes tumor progression in an autocrine manner，影响因子为11.3分。肿瘤微环境与结直肠癌的发生、发展密切相关。癌症相关成纤维细胞作为TME的重要组分可通过分泌外泌体和细胞因子促进CRC的发展。在本篇文章中研究人员利用在线数据库的多个不同类型的数据及自测的CRC患者的测序数据进行分析挖掘CRC的新治疗靶点。

研究背景

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症。虽然许多研究发现不同细胞之间的相互作用可以促进结直肠癌的进展和转移，但其潜在机制是复杂的，并且仍然不清楚。肿瘤微环境（TME）与结直肠癌的发生、发展密切相关。

在CRC中，基质细胞在TME中被激活并增加胶原和胶原重塑酶的分泌，导致ECM的连续重组。癌症相关成纤维细胞（CAF）包括癌症相关间充质干细胞是TME中最丰富的基质细胞，并且通过直接细胞接触或旁分泌细胞因子在癌细胞和基质中发挥多种作用，从而促进ECM沉积和重塑、与癌细胞的广泛串扰、上皮-间充质转化（EMT）、侵袭、转移和治疗抗性。

MYL9，也称为MLC2和MRLC1，是一种蛋白质编码基因，近年来被认为在各种癌症中发挥重要作用。MYL9在乳腺癌、食管鳞状细胞癌、肝癌和上皮性卵巢癌中的高表达与不良预后相关，而MYL9在非小细胞肺癌、膀胱癌和前列腺癌中的低表达与不良预后相关。然而，研究人员发现在CRC组织中，其表达在CAFs中显著占优势。因此，研究人员进一步探讨了MYL9表达如何影响肿瘤的生物学功能。此外，研究人员探索了CRC的新治疗靶点，并确定了免疫治疗和预后的潜在生物标志物。

原名：MYL9 expressed in cancer‑associated fibroblasts regulate the immune

microenvironment of colorectal cancer and promotes tumor progression in an autocrine manner

译名：在癌症相关成纤维细胞中表达的MYL9调节结直肠癌的免疫微环境并以自分泌方式促进肿瘤进展

期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影响因子：11.3

发表时间：2023.11.06

通讯作者：Yinghao Cao  Kailin Cai

通讯作者单位：华中科技大学同济医学院协和医院肝移植中心

DOI: 10.1186/s13046-023-02863-2.

主要结果

1.1 CAFs中MYL9的高表达提示结直肠癌的临床病理特征和预后不良。

使用三个单细胞测序队列（GSE132465，GSE144735，Zhou et al.）进行CAFs和正常成纤维细胞之间的差异基因分析，结果显示COL1A1，ADAMDEC1，CXCL 14，TAGLN和MYL9在CAFs中表达增加。其中MYL9与结直肠癌预后密切相关。MYL9表达与结直肠癌患者的OS、无病生存期（DFS）、疾病特异性生存期（DSS）、无复发生存期（RFS）和无进展生存期（PFS）相关。根据GEPIA数据库，MYL9高表达与OS和DFS较差相关（分别为p = 0.013和p = 0.039）。在PrognoScan数据库中，研究人员还发现MYL 9过表达与CRC的OS和DFS之间有很强的相关性。此外，两个队列GSE38832和GSE40967，被纳入预后分析。在GSE38832组群中，MYL9高表达具有更差的DFS和DSS（分别为p = 0.016和p = 0.047）。在GSE40967队列中，尽管MYL9高表达与OS无显著相关性，但MYL9高表达与RFS较差相关（分别为p = 0.265和p = 0.035）。这些结果表明，MYL9的活性转录可能导致健康风险，并且MYL9可能是CRC患者的潜在预后生物标志物（图1A）。

为了研究MYL9 mRNA表达与CRC患者临床病理特征之间的关系，对TCGA和GEO数据库（GSE29621、GSE38832、GSE40967和GSE103479）进行了分析。在TCGA组群中，MYL9的高表达与CRC的高龄、N期、M期和TNM期密切相关（图1B）。在GEO队列中，组合多个数据集后发现了与TCGA队列相似的结果（图1C）。两个研究队列的结果提示，MYL9在N2、M1期患者中的表达高于N0、M0期患者，在IV、III期CRC患者中的表达明显高于I、II期CRC患者，提示MYL9的表达与CRC的发生、转移密切相关。研究人员还分析了MYL9表达在31例非CRC肿瘤中的预后价值。考虑到MYL9是否是肿瘤中重要的免疫治疗靶点需要进一步研究，研究人员对MYL9表达和免疫调节剂进行了泛癌分析。结果表明MYL9表达与多种免疫抑制剂、免疫刺激剂和各种肿瘤中的主要组织相容性复合物分子正相关（图S1D）。对MYL9进行了药物敏感性分析发现MYL9高表达的患者对受体酪氨酸激酶抑制剂高度敏感（图S1E）。因此，MYL9的表达与多种肿瘤的预后和肿瘤免疫密切相关，可能成为肿瘤预后和免疫治疗的潜在靶点。

Fig. 1 Screening and clinicopathological characteristics of MYL9.

1.2 MYL9定位于CAFs，其总蛋白表达在CRC中升高。

MYL9在结直肠癌中的表达水平及其定位仍有争议。为了确定MYL9定位和表达水平，使用多个群组进行验证。使用GEPIA数据库分析结肠癌、直肠癌和正常组织中的MYL9的mRNA表达水平。结果显示结肠癌和直肠癌中的MYL9的 mRNA表达低于正常组织（图2A）。在GSE87211中，肿瘤和正常组织之间的MYL9的 mRNA表达没有显著差异（图2B）。在本篇文章的150对CRC转录组数据中，研究人员发现肿瘤中的MYL9的 mRNA表达低于正常组织（图2C）。此外，30对新鲜CRC组织的qRT-PCR分析显示出类似的结果（图2D）。

在蛋白水平方面，10对新鲜CRC样本的蛋白质印迹和IHC结果表明，肿瘤组织中的总MYL9蛋白水平高于正常组织中的总MYL9蛋白水平（图2E、F）。IHC结果显示MYL9主要在肿瘤基质中表达（图2F）。随后，研究人员进行了组织免疫荧光验证，免疫荧光结果表明MYL9在肿瘤中的蛋白表达水平高于正常组织，并且主要集中在肿瘤间质中（图2G）。为了明确MYL9的位置，对单细胞测序数据（GSE132465、GSE144735）的分析显示，MYL9主要在组织干细胞和成纤维细胞中表达，在上皮细胞中表达较少（图S2A）。因此，研究人员假设MYL9在CAF中发挥作用以影响CRC进展。使用TIMER 2.0数据库，发现MYL 9的表达与结肠癌和直肠癌中的CAF浸润高度相关（COAD，r > 0.8，p < 0.0001; READ，r > 0.6，p < 0.001）（图S2 B）。

此外，组织免疫荧光显示MYL9和CAFs标记蛋白a-SMA在肿瘤间质中共表达。随着CRC的 TNM分期的增加，MYL9和CAF的表达水平也增加，而MYL 9的表达水平在正常组织中较低（图2 H）。最后，研究人员成功地从四名CRC患者中分离了原代CAF，并且细胞免疫荧光也证实了MYL9在CAF中表达（图2 I，图S2 C，D）。对原代CAFs进行鉴定和培养后，将稳定增殖的原代CAFs作为CAFs细胞系进行进一步研究。组织免疫荧光显示MYL9在CAFs中稳定表达，考虑到分离的原代CAFs也是稳定培养和传代的。因此，研究人员通过蛋白质印迹法验证MYL9在CAF、肿瘤细胞系（LoVo、SW 480和HCT 116）和正常细胞系（NCM460）中的表达，发现MYL9在CAF中稳定表达，而在CRC和正常细胞系中表达较少（图S2E）。因此，研究人员发现MYL9主要定位于CAFs并且其蛋白表达在CRC中升高。

Fig. 2 The expression level of MYL9 gene in CRC and cell localization.

1.3 CAFs中MYL9敲降抑制了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。

鉴于CAF在CRC进展中起重要作用，研究人员假设MYL9敲降可以抑制CAF对CRC的影响。为了验证这一点，研究人员收集了来自用siRNA沉默MYL9的原代CAFs的条件培养基（CM），并将其与LoVo和SW 480细胞共培养以检测其生物学功能。集落形成实验显示MYL9敲降显著抑制CRC细胞的增殖能力（图3A，图S2F）。Transwell测定显示，当MYL9在CAF中沉默时，CRC细胞的迁移和侵袭能力被显著抑制（图3B）。此外，划痕实验表明MYL9敲降抑制了CRC细胞迁移（图3C）。这些结果证实CAFs中MYL9的高表达可能是CRC细胞体外增殖、迁移和侵袭的关键。

Fig. 3 Silencing MYL9 in CAFs inhibited the proliferation, migration, and invasion of LoVo and SW480 cells.

1.4 MYL9的高表达与M2巨噬细胞的高浸润相关。

肿瘤与TME密切相关，常被称为“种子”与“土壤”的关系。研究人员在TCGA数据库中对CRC 的TME进行评分，并与MYL9进行相关性分析。结果显示CRC和MYL9的表达与肿瘤免疫和基质评分具有较强的相关性，表明MYL9可能在TME中起重要作用（图S3A）。免疫细胞浸润与肿瘤预后相关，虽然有生物信息分析表明MYL9对CRC肿瘤免疫细胞浸润有影响，但缺乏数据验证。因此，研究人员使用TCGA、GEO数据库和本篇文章研究人员自测的CRC转录组数据作为验证队列，以分析MYL9表达和免疫细胞浸润之间的差异和相关性。研究人员对三个队列的结果进行了综合分析，发现CRC中MYL9的高表达与低CD4记忆静息T细胞、活化的树突状细胞和高M2巨噬细胞浸润密切相关。

TIMER和GEPIA数据库用于研究结肠癌和直肠癌中MYL9表达与各种免疫细胞标志物基因之间的关系。结果显示，MYL9表达水平与结肠癌和直肠癌中各种免疫细胞的最显著标志物基因显著相关，包括M2巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和树突状细胞（补充文件1：表6）。最后，研究人员对20例石蜡包埋的CRC样本进行了多次免疫荧光检测，以验证MYL9与CD4记忆静息T细胞、活化树突状细胞和M2巨噬细胞之间的关系。结果表明，MYL 9和CD 163表达之间存在显著的正相关性MYL 9与CD 83表达呈负相关（R = 0.85，p < 0.001）CD 4、CD 45 RO表达与MYL 9表达呈负相关（R = -0.33，p = 0.16（分别为R = -0.26，p = 0.26; R = -0.13，p = 0.58）（图4A，B）。因此，MYL 9的表达与M2巨噬细胞浸润密切相关。

考虑到肿瘤中TAM的丰度，TME具有混合的巨噬细胞群体，并且TAM的变化也可以影响单核细胞的促肿瘤和抗肿瘤活性之间的平衡。进一步分析MYL9与TAM表达的关系。使用石蜡包埋的CRC标本的连续切片，通过免疫荧光和IHC确定MYL9表达与M0、M1和M2巨噬细胞浸润之间的关系。组织免疫荧光结果表明，MYL9表达与M2巨噬细胞浸润密切相关，但与M0和M1巨噬细胞浸润弱相关（图4C）。通过IHC获得了类似的结果。在MYL9高表达区域，M2和M0巨噬细胞的阳性比例显著高于M1细胞（图S3E）。随后，在用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为M0巨噬细胞后，共培养有或没有MYL 9敲降的CAFs以确定MYL 9是否能诱导M0细胞分化为M1或M2巨噬细胞，PCR结果显示MYL 9敲降后，与正常CAF相比，M0分化成M2巨噬细胞显著减弱（图4D）。流式细胞术还显示，与正常CAF组相比，MYL 9敲降后M2细胞的百分比显著降低（图4 E）。因此，研究人员认为位于CAFs中的MYL 9可以促进M0向M2巨噬细胞的极化。

Fig. 4 High expression of MYL9 was associated with CRC immunosuppressive microenvironment.

1.5 MYL9表达可预测结直肠癌临床免疫治疗效果。

由于MYL9主要在CAF中表达，为了进一步阐明MYL9在免疫治疗中的作用，研究人员根据MYL9的表达将TCGA、GEO和自测数据的验证队列分为高表达组和低表达组分析MYL9表达与常见免疫检查点的关系。三组的结果显示MYL 9表达与PTPRC、CD 8A、LAG 3、TNFRSF 18、PDCD 1 LG 2、CD 274、LDHBTNFRSF 4、HAVCR 2、CD 86、CD 40和TNFSF 4表达相关（图5A-D）。

MSI和TMB被认为是预测结直肠癌预后和免疫疗效的重要分子标志物。因此，研究人员分析了TMB、MSI和MYL 9表达之间是否存在相关性。在三组数据中分析发现MYL 9表达与MSS、MSI-L和MSI-H之间没有发现显著差异（图5E、F），并且在TMB和MYL 9表达之间存在负相关性（r =-0.23，p = 0.0014）。进一步的研究发现，具有高MYL 9表达和低TMB的CRC患者具有比其他组中的那些更差的OS（图5G）。

接下来，研究人员进一步探究了MYL9是否可以预测患者对免疫检查点阻断疗法的反应。首先分析了MYL9和CRC IPS的表达。结果显示高MYL9表达与较低的IPS相关，这也表明具有高MYL9表达的CRC患者具有较低的免疫原型和较差的免疫应答（图5H）。考虑到MYL9的表达可以影响CRC患者对免疫治疗的反应，研究人员使用GSE78220（n = 28），GSE19423（n = 48），Miao et al.（n = 35）和IMvirgor210（n = 298）队列来研究MYL9表达是否可以预测患者对免疫治疗的反应。在GSE78220队列中，较高的MYL9表达与较差的免疫治疗应答相关（p = 0.025）。在GSE19423、Miao等人和IMvirgor210组中，尽管MYL9的高表达和低表达与免疫治疗应答之间没有统计学显著差异，但这些组群中MYL9的高表达倾向于导致较差的免疫治疗应答（图5I）。总体而言，在分析MYL9与免疫检查点、TMB和免疫治疗之间的关系时，研究人员发现MYL9高表达的患者从免疫检查点治疗中获益较少，MYL9可能是免疫治疗的新靶点。

Fig. 5 The high MYL9 expression was not sensitive to tumor immunotherapy.

1.6 MYL 9可能通过调节CAFs分泌的CCL2和TGF-β1募集或调节M2巨噬细胞浸润。

CAF通过直接细胞接触或旁分泌细胞因子对癌细胞发挥多种作用。因此，研究人员关注于MYL 9是否调节CAFs细胞因子分泌。同样，TCGA，GEO和自测数据的验证队列根据MYL 9的表达分为高低表达两组，并观察MYL 9的表达与一些常见的细胞因子和趋化因子之间的关系。在三个组中，提示MYL 9高表达与HGF、CXCL 1、CX 3CL 1、CCL 8、CCL 7、CCL 26、CCL 20、CCL 2、TGFB 1和IL 10表达密切相关（图6A-D）。qRT-PCR验证后，研究人员发现MYL 9敲降后CCL 2、TGF-β1、IL-10和CXCL 1的表达降低，其中CCL 2和TGF-β1的变化尤为显著（图6 E，图S4 A）。在四个分离的原代CAF病例中敲降MYL 9，并提取细胞上清液用于ELISA。结果显示在MYL 9敲降后，CCL 2、IL-10、CXCL 1和TGF-β1的蛋白水平降低，并且CCL 2和TGF-β1的稳定降低更显著（图6 F）。这些结果强烈表明MYL 9调节CAFs中细胞因子和趋化因子的分泌。

Fig. 6 MYL9 silencing can reduce CAFs secretion of CCL2 and TGF-β1.

1.7 CAFs分泌CCL 2和TGF-β1，协同促进CRC的增殖、迁移和侵袭。

除了影响TME之外，CCL 2和TGF-β1是否可以独立或协同地促进CRC仍不清楚。研究表明，CCL 2和TGF-β1均可促进CRC进展。然而，MYL 9是否通过CCL 2或TGF-β1或两者促进CRC进展需要进一步研究。将重组蛋白CCL 2（20 ng/mL）和TGF-β1（0.1 ng/ml）应用在LoVo和SW480细胞检测其生物学功能。CCK-8细胞增殖试验结果显示，与单独使用相比，TGF-β1和CCL 2的组合显著提高了CRC细胞的增殖能力（图S4 B、C）。Transwell迁移和侵袭试验还发现，与对照组、CCL 2和TGF-β 1组相比，CCL 2和TGF-β1联合后LoVo和SW480细胞的迁移和侵袭能力显著增强（图S4 D）。因此，研究人员发现MYL 9通过调节CAFs中CCL 2和TGF-β1的分泌在CRC进展中起作用。

1.8 CAFs中MYL9基因敲降抑制大肠癌细胞的体内增殖和转移。

为了研究CAFs中MYL9基因敲降对结直肠癌的生物学效应，研究人员使用慢病毒稳定敲除CAFs中的MYL9基因，将MYL9基因敲除或未敲除的CAFs和LoVo细胞以1：1的比例皮下和静脉注射到裸鼠体内诱导肿瘤发生和转移。在MYL 9被敲除后，ShMYL 9 + LoVo组比LoVo和CAF + LoVo组肿瘤进展减缓和肺转移性结节减少（图7A、B、图S4 E）。

1.9 MYL 9可能通过CCL2/ TGF-β1/PI3K/AKT轴促进CRC进展。

体内和体外研究证实，沉默或敲低MYL 9可以抑制CRC细胞的增殖和转移。为了探索MYL 9的生物学功能和信号通路，研究人员将MYL 9的表达分为高表达组和低表达组，用于KEGG和GO富集分析。MYL 9和CRC之间的信号传导途径主要涉及PI3K-AKT途径（图7 C，图S5）。为了验证这一结果，在CAF中MYL9沉默后，收集CM并与CRC细胞（LoVo和SW 480）共培养，并通过蛋白质印迹法观察PI3K-AKT通路中的蛋白质变化。研究结果表明PI3K，AKT，p-PI3 K，p-AKT蛋白在LoVo细胞与CAFs的共培养后增加，p-PI3 K和p-AKT蛋白水平MYL9沉默后降低。在SW480细胞中，其中在MYL9沉默后p-PI3 K和p-AKT的磷酸化也降低（图7 D）。

已经证实MYL 9可以减少CAFs分泌CCL 2和TGF-β1，而CCL 2与TGF-β1联合可以促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，为了检验MYL 9是否通过CCL 2/ TGFβ1/PI 3 K/AKT轴作用于CRC的假设，用重组CCL 2（20 ng/mL）、TGF-β1（0.1 ng/mL）和PI 3 K-AKT途径抑制剂LY 294002（0.5 ug/ mL）处理CRC细胞。Western blotting结果显示，CCL 2联合TGFβ1可促进LoVo和SW 480细胞PI3 K、p-PI 3 K、AKT和p-AKT的表达。在应用PI3K抑制剂（LY 294002）后，它可以阻断由CCL2与TGF-β1联合刺激的LoVo和SW 480细胞中的PI3K和AKT磷酸化（图7 E）。因此，CAFs中的MYL 9通过调节CCL 2和TGF-β1的分泌以及通过PI3 K-AKT通路促进CRC细胞的增殖。

1.10 敲降CAFs中MYL9表达可抑制结直肠癌EMT进展

MYL 9在CAFs中的表达不仅影响CRC细胞的增殖，而且还促进其迁移和侵袭。目前研究证实TGF-β是EMT的主要诱导剂，可促进CRC的EMT过程。研究发现MYL 9可以调节TGF-β1的分泌，从而对TME和EMT产生影响。因此，研究人员推测MYL 9也可以促进CRC的 EMT的发生。为了验证这一假设，在使用siRNA在CAF中沉默MYL 9后提取CM，并与CRC细胞共培养。结果显示，在MYL 9沉默后，LoVo和SW 480细胞中N-钙粘蛋白、波形蛋白和转录因子ZEB 1的表达降低，而E-钙粘蛋白的表达增加（图7 F）。因此，研究人员发现CAF中的MYL 9促进CRC细胞中的EMT进展。

Fig. 7 In vivo experiment and mechanism pathway validation.

1.11 MYL 9通过ERK 1/2途径与IQGAP 1结合调节CAFs中CCL 2和TGF-β1的分泌

CCL 2的分泌受ERK 1/2途径调节。此外，TGF-β1在肿瘤与基质细胞相互作用期间激活MAPK通路。因此，研究人员推测MYL 9可能通过ERK 1/2途径调节CAFs中CCL 2和TGF-β1的分泌。为了验证这一推测，研究人员在CAFs中敲降了MYL 9基因。Western印迹显示MYL 9敲降可降低CCL 2和TGF-β1的蛋白水平，而ERK 1/2和p-ERK 1/2的水平没有显著变化（图8A）。基于这一结果，研究人员认为MYL 9不直接作用于ERK1/2通路，而是可能与某种蛋白质结合后作用于该通路。蛋白质光谱分析显示MYL 9可能与IQGAP 1结合。IQGAP 1具有5个主要结构域，通过这些结构域，IQGAP 1与其他蛋白质结合并调节ERK 1/2信号通路，这已在多项研究中得到证实。为了验证MYL 9是否可以结合IQGAP 1，Co-IP实验证实MYL 9可以结合IQGAP 1蛋白（图8B）。MYL 9和IQGAP 1是否通过ERK 1/2通路调控CCL 2和TGF-β1的表达有待进一步验证。通过在CAFs中过表达MYL 9、沉默MYL 9及IQGAP 1，研究人员发现同时沉默IQGAP 1及MYL 9可以降低CCL 2、TGF-β1和p-ERK 1/2的表达。当MYL 9过表达且IQGAP 1沉默时，与对照组相比，CCL 2、TGF-β1和磷酸化p-ERK 1/2的蛋白水平没有显著变化（图8A，图S6 A，B）。因此，研究人员认为IQGAP 1是MYL 9的关键结合蛋白，MYL 9通过与IQGAP 1结合并作用于ERK 1/2通路来调节CAFs分泌CCL 2和TGF-β1。

1.12 转录因子ZEB 1诱导CAFs表达MYL9。

在分子水平上，EMT转录因子，包括Snail、ZEB1和Twist1，通过产生趋化因子吸引免疫抑制细胞或促进免疫抑制检查点分子的表达，从而形成肿瘤免疫抑制微环境。同时，它还可以参与细胞的其他功能，如细胞增殖、细胞凋亡和转移。本研究发现CAFs中MYL 9不仅可以促进CRC的EMT过程，还可以通过与IQGAP 1结合，通过ERK 1/2途径调节CCL 2和TGF-β1的分泌。因此，研究人员假设MYL 9和EMT转录因子之间存在调节关系。首先，使用TIMER 2.0数据库评估了MYL 9表达与Snail、ZEB 1和Twist 1之间的相关性。在MYL 9和ZEB 1之间发现了强相关性（图S6 C，补充文件1：表7）。石蜡包埋的结直肠癌标本用于免疫荧光检测MYL9与ZEB1的共定位。免疫荧光结果显示，ZEB1和MYL9明显位于肿瘤细胞和CAF的交界处，这也可能表明MYL9和ZEB1在肿瘤的EMT或侵袭过程中存在相互作用(图S6D)。另外，分别沉默MYL 9和ZEB 1基因，通过细胞免疫荧光观察MYL 9和ZEB 1的共定位关系。结果表明，ZEB 1和MYL 9的共表达在ZEB 1和MYL 9分别沉默后显著减弱。在沉默ZEB 1后，MYL 9表达也降低（图S6 E、F）。为了进一步验证ZEB 1和MYL 9之间的可能关系，蛋白质印迹显示MYL 9、p-ERK 1/2、CCL 2和TGF-β1的表达随着ZEB 1的沉默而降低（图8 C）。

接下来研究人员开始关注ZEB1是否可以调节MYL9的功能。用JASPAR数据库来分析MYL9启动子序列和ZEB1的相对得分。ZEB1和MYL9的相对评分> 0.8，可能存在4个潜在结合位点（补充文件1：表8）。同时，利用CUT&Tag技术检测ZEB 1是否能与MYL 9结合，结果表明ZEB 1在原代CAF中能与MYL 9显著结合（图8D、E、F）。使用ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因测定验证了这一点。根据ChIP-qPCR结果，ZEB 1可以结合MYL 9的启动子区（P3，P4）（图8 G，图S6 G）。双荧光素酶报告基因测定进一步显示ZEB 1可以增强MYL 9的启动子活性（图8H）。结果表明转录因子ZEB 1可以与MYL 9结合并调节其生物学功能。

CAF和CRC之间的恶性反馈回路已被广泛研究。研究人员假设CRC进展影响CAFs中ZEB1的表达和MYL9的功能。将CRC细胞与CAFs共培养以观察CRC细胞是否引起CAFs中ZEB 1和MYL9的表达，PCR和蛋白质印迹证实与CRC细胞共培养可促进CAFs中ZEB 1和MYL9的基因水平和蛋白质表达（图8I，J），并且ZEB 1和MYL9在CAFs中的表达可进一步促进CRC的进展。因此，位于CAFs中的MYL 9可与IQGAP 1相互作用，通过ERK 1/2调节TGFβ1和CCL 2的分泌，而CCL 2和TGFβ1不仅可影响CRC的免疫微环境，还可通过PI 3 K/AKT的协同作用促进CRC的增殖。MYL 9的表达也可能促进大肠癌的EMT进程。此外，本篇文章首次发现ZEB 1可以与MYL 9结合以调节MYL 9的活性，并且CAF中的ZEB 1可以在CRC进展过程中产生或进一步促进，从而在CAF和CRC细胞之间形成正反馈效应（图8 K）。

Fig. 8 Upstream and downstream regulation mechanism of MYL9 in CAFs.

小编寄语

TME是由各种细胞和组织结构组成的聚集体，包括肿瘤细胞、免疫相关细胞、癌症相关成纤维细胞（CAF）、细胞外基质（ECM）、血管和淋巴管。TME参与免疫细胞的激活和募集、血管生成和细胞外基质重构，是调节癌症发生和发展的重要因素。近年来，肿瘤微环境的相关研究成为备受关注的热点之一。本篇文章也为大家提供了很好的分析思路。此外，肿瘤微环境与免疫治疗及耐药密切相关，并为肿瘤治疗靶点的研究提供新的方向。

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项傅马3060matlab里矩阵的正交分解怎么表示 -
霍倪邵18737712107 ______ 矩阵分解 (decomposition, factorization)是多半将矩阵拆解为数个三角形矩阵(triangular matrix). 依使用目的的不同 ,可分为三种矩阵分解法:1)三角分解法 (Triangular Factoriz...

项傅马3060平均数能较好的反映什么的总体情况 -
霍倪邵18737712107 ______ 平均数能较好的反应一组数据的总体水平,但它很容易受到极端数据的影响,所以有时不太适合用平均数.

项傅马3060电大考试成绩单中的综合成绩、考试成绩、形成成绩、形成比例分别是什么意思? -
霍倪邵18737712107 ______ 一共分为:考试成绩、形考成绩、形考比例、综合成绩; 考试成绩是指你正式考试时候的成绩、形考成绩是指你老师给你的平时成绩; 具体算法是这样的,计算公式:考试成绩 乘(1 减去 形考比例)加上 形考成绩 乘 形考比例,最后得出的就是综合成绩了. 希望能帮到你~