takara试剂盒

1 探针的设计与合成

1) 根据实验室已有的 p8 基因 cDNA 全长序列，用 premier primer5.0 设计引物 p81 和 p82，以卤虫 cDNA 为模板，PCR 扩增得到 346bp 的产物，用 Takara 胶回收试剂盒 回收纯化。

2)\t目的片段克隆

a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在 1:3-1:8，根据凝 胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：

目的 PCR 片段\t5 μl

pGM-T 载体（约 50ng/uL）\t1 μl

10×T4 DNA Ligation Buffer\t1 μl

T4 DNA Ligase（3U/uL）\t1 μl

无菌去离子水\t3 μl

总体积\t10 μl

b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于 PCR 仪中 16℃过夜连接，反应结束后 将离心管置于冰上。

c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入 16 μl 的 IPTG（50mg/ml）、40 μl 的 X-gal（20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于 37℃培养箱 1-3 小时， 使溶解 X-gal 的二甲基甲酰挥发干净。

d.  将 10 μl 的连接产物加到 100 μl DH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于 42℃水浴 90 秒，取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入 500 μl 37℃预热的 LB（不含抗生素）培养基，150rpm 摇床 37℃振荡培养 45 分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于 4000g 下离心10 分钟，去掉上清，加入 100 μl 培养液重溶并加入到配制好的 LB 固体培养基上，用无菌 的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养 12-16 小时。 e.  挑取白色菌落直接进行 PCR 检测，筛选转化子。

f. 将转化子接种于 LB 液体培养基中培养 24 小时，吸取 1mL 菌液送至大连宝生物公司进行 序列测序。

3)\t重组质粒的线性化

取 6 μl 以测序的重组质粒，选取 NcoI 内切酶 37℃酶切 4h。酶切反应体系为 20 μl： 质粒\t6 μl

10xK Buffer\t2 μl

NcoI 酶\t1 μl

0.1% BSA\t2 μl

灭菌水\t9 μl

终体积\t20 μl

取酶切前后的质粒各 4  μl，经 1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用 Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。

4)\t探针合成

按罗氏 DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义 RNA 探针。 使用的所有试剂和器皿均经去  RNase  处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free 的微离心管中顺序加入下列试剂:

纯化的线形质粒\t1 μg

Rnase-free dH2O\t\tup to 13 μl 10xNTP labeling mixture\t2 μl

10xTranscription buffer\t2 μl

Rnase inhibitor\t1 μl

SP6 RNA Polymerase\t2 μl

总体积\t20 μl

稍混匀，短暂离心将反应液集于管底，37℃ 2 h。反应结束后再补加 2 μl DNase I，37℃ 15 min，反应结束后加入 0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取 3-5 μl 反应产物 1%琼脂糖凝胶电泳 检测。-20℃保存备用。

2. 石蜡切片的制备

◆本实验在杂交结束前均必须保证 RNase-free.玻璃器皿采用 180℃烘烤 10 小时。其它采 用 DEPC 处理，高温灭菌锅高温降解 DEPC。若仪器不能高温处理，可用 3%的 H2O2 处理 半小时以上，DEPC 水冲洗干净，烘干。

1)\t组织的固定与包埋 选取不同发育时期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的卤虫，经 DEPC 处理水冲洗表面盐分后，加入新鲜配制的 4%多聚甲醛，于 4℃固定 5-8 h，再分别按下列 顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水 1 h，50%乙醇脱水 1 h，70%乙醇脱水 1 h，80%乙醇脱水乙醇脱水 1 h，90%乙醇脱水 1 h，无水乙醇脱水 1 h，无水乙醇脱水 1 h，无水乙醇:二甲苯(1:l)透明 10 min，二甲苯透明 10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1)浸蜡 30 min，54℃石蜡浸蜡 1 h，54℃石蜡包埋。

2)\t组织切片：将包埋的组织按 7 μm 的厚度切片，在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加 DEPC处理水，组织片于 42℃展片台上展片 1 小时，再置于 40℃恒温箱中烘片 12 小时后放于 4℃密封保存备用。

3. 杂交前处理

切片经二甲苯脱蜡 2×15 min，无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30% 乙醇脱水各 5 min，后 DEPC 处理水 2×5 min，然后进行杂交前切片处理，具体步骤如下: 1)    lxPBS(pH7.4)室温孵育 2x5 min。

2)  0.3%TtitonX-100 的 PBS 中去膜处理 15 min。

3)  lxPBS 洗涤 2x5 min。

4)  无 RNase 的蛋白酶 K(20 mg/mL)37℃消化 30 min。

5) 100mMGly/PBS 中洗 2x5 min。

6) lxPBS 洗涤 2x5 min。

7)    4%多聚甲醛(4℃)固定 5min。

8)  lxPBS 洗涤 2x5 min。

9)\t含有  0.25%(W/v)的乙酸酐的  100mM  的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电荷处理  15 min(现配现用)。

10) lxPBS 洗涤 2x5 min。 

4.预杂交和杂交

1)  滴加预杂交液于载玻片上，然后置于湿盒中，50℃预杂交 2 小时。

2)    弃去预杂交液，立即滴加杂交液，置于湿盒中 52℃杂交过夜。

5.杂交后处理 杂交完，以后的步骤不必要特意防 RNA 酶。

1)\t弃去杂交液，载片浸入 2xSSC 中 2x15 min。

2)\t载片浸入 1xSSC 中 55℃水浴摇动 2x15 min。

3)\t用含 20mg/mL 的 RNaseA 的 NTE 缓冲液 37℃消化 30 分钟，以去除未结合的探针。

4)\t载片浸入 0.5xSSC 中 55℃水浴摇动 2x15 min。

5)\t载片浸入 0.5xSSC 中室温 10 min。

6. 抗体反应

1)\t用 washing buffer 清洗组织片 5 min。

2)\t滴加封闭液缓冲液室温下处理组织片 30 min。

3)\t用抗体液覆盖封闭后的组织片，置于湿盒中孵育 3h 以上。

4) Washing buffer 洗 2x15 min。

5) Detection buffer 中平衡 2-5 min。

7.  显色：加入显色液于湿盒中黑暗静止显色 16h

8. 封片与观察：

1)\t显色合适时，用 TE buffer 终止着色反应，再用蒸馏水清洗。

2)\t滴加封片剂封片，显微镜下观察和摄影。

鄂保萧214020ul双酶切体系和10ul双酶切体系的区别 -
桑庙王13153955876 ______ 20ul双酶切体系和10ul双酶切体系的区别:DNA的量是3.5微升 1、产物浓度不同 20ul双酶切体系比10ul双酶切体系产物的浓度高. 2、DNA反应量不同 20ul双酶切体系所含DNA要比10ul双酶切体系含有的DNA多,进行双酶切时所要切的DNA量也...

鄂保萧2140takala荧光定量试剂盒有毒吗 -
桑庙王13153955876 ______ 这个问题好神奇.吃的话应该没问题.不管是哪个公司的试剂盒,里面包含的无非就是反转录酶,扩增酶(这两种本质是蛋白,能消化的).荧光染料 SYBR green,这个染料也是低度的,可以替代EB的低度染料.和一些无机盐的缓冲液.也是没有有毒的物质.如果要是直接注射,就不知道了

鄂保萧2140takara race试剂盒怎么样 -
桑庙王13153955876 ______ 一般吧,要求高的话用invitrogen和ambion的.ambion很好的 http://emuch.net/html/200904/1298851.html

鄂保萧2140请教反转录cDNA的体系中,Random 6 mers是什么啊? -
桑庙王13153955876 ______[答案] 这个体系是TaKaRa反转录试剂盒中的体系,稍有不同的是第二个PrimeSciptTMRT Enzyme Mix I,试剂盒中为0.5μL.Total RNA试剂盒中没有标明使用量,根据自己提取的RNA浓度来确定,但你这里的使用量应该有点大,试剂盒中有说明,10μL体系...

鄂保萧2140RT - PCR试剂盒保存于4°一星期,有什么影响没有? -
桑庙王13153955876 ______ 影响肯定有的,酶活会降低很多.但是如果要用还是可以用的,酶稍微多加点.但最好以后再也别放4度了

鄂保萧2140DNA a - tailing kit的作用是什么..简单的酶切酶连? -
桑庙王13153955876 ______ ■ 制品内容 (20 次量)A-Tailing Enzyme (5 U/μl)10 μl10*A-Tailing Buffer100 μldNTP Mixture (each 2.5 mM)80 μlA-Tailing Control Insert* (50 ng/μl)10 μlBlunting Control Insert* (50 ng/μl)50 μl * A-Tailing Control Insert 和Blunting Control Insert各为5...

鄂保萧2140什么是靶基因步行PCR -
桑庙王13153955876 ______ 靶基因步行PCR也就是通常所说“染色体步移” 从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆,该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序.从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端...

鄂保萧2140怎么看荧光定量PCR的试剂盒好不好 -
桑庙王13153955876 ______ 如果你想做荧光定量PCR的根据实验思路来说应该需要一下试剂和仪器1.模板提取(一般为RNA):Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理水2.模板浓度测定:分光光度计或NanoDrop3.逆转录:逆转录试剂盒(或者一步法试剂盒),这一步可以用普通PCR做,也可以用水域做.4.荧光定量PCR试剂:通常有用SYBR Green Mix做的,但是这里建议你用EvaGreen做,灵敏度和平行性都要好于SYBR Green,并且如果你那是ABI或者Stratagene的PCR如果用SYBR Green还需要加一步Rox很麻烦.5.其他:除了以上的那些还需要离心管、PCR管或板(Axygen反应比较好)、移液枪等,暂时就想到这么多.

鄂保萧2140toyobo和takara哪个好 -
桑庙王13153955876 ______ T〇YOBO

鄂保萧2140反转录问题求教!!!
桑庙王13153955876 ______ 如果你是用反转录后的cDNA跑电泳,出现好多条带或弥散状是正常的,因为你提取的RNA不可能是完整的一条链,而随机引物和特异引物扩增的时候是有肯能把大小不同的RNA同时进行扩增的. 你可以用你的目的引物,用反转录第一链进行扩增,看看能不能得到目的片段.