凝胶层析上样量与洗脱
原理:在变性条件下将待检的 RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的 RNA 探针进行反应。
用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。
实验方法:
[仪器、试剂、材料]
(一)仪器恒温水浴箱,电泳仪,凝胶成像系统,真空转移仪,真空泵,UV 交联仪,杂交炉,恒温摇床,脱色摇床,漩涡振荡器,分光光度计,微量移液器,电炉(或微波炉),离心管,烧杯,量筒,三角瓶等。
(二)材料总 RNA 样品或 mRNA 样品,探针模板 DNA(25 ng),尼龙膜
(三)试剂:NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),琼脂糖,DEPC, X 光底片,底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-freeKlenow Fragment 和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]
1.用具的准备:
180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用 DEPC 水冲洗,干燥备用。处理 DEPC 水(2 L)备用。
2.用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用 DEPC 水冲洗二次,去除 RNAZap。
3.制胶:
1. 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中,加入32.4mlDEPC 水后,微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加 DEPC 水补充蒸发的水分)
2. 在通风厨中加入3.6ml 的10*Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。
3. 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒或其它方法去除,或将气泡推到胶的边缘。注:胶的厚度不能超过0.5cm。
4.胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer 盖过胶面约1cm,小心拔出梳子。(配制250ml\t1×MOPS Gel Running buffer,在电泳过程中补充蒸发的 buffer。)
5.检查点样孔。
4. RNA 样品的制备
在 RNA 样品中加入3倍体积的 formaldehyde load dye 和适当的 EB(终浓度为10ug/ml)。
混匀后,65℃空气浴15min。短暂低速离心后,立即放置于冰上5min。
5.电泳:
1.将 RNA 样品小心加到点样孔中。
2.在5V/cm 下跑胶(5x14cm)。在电泳过程中,每隔30min 短暂停止电泳,取出胶,混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。
3.紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。
6.转膜
1.用3%双氧水浸泡真空转移仪后,用 DEPC 水冲洗。
2.用 RNAZap 擦洗多孔渗水屏和塑胶屏,用 DEPC 水冲洗二次。
3.连接真空泵和真空转移仪,剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的 5mm),膜在 Transfer buffer 浸湿5分钟后,放置在多孔渗水屏的适当位置。 4.盖上塑胶屏,盖上外框,扣上锁。
5.将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔,并至少盖过边缘约2mm,以 防止漏气。
6.将胶小心放置在膜的上面,膜与胶之间不能有气泡。
7.打开真空泵,使压强维持在50~58mbar;立即将 transfer buffer 加到胶面和四周。每 隔10min 在胶面加上1ml transfer buffer,真空转移2小时。
8.转膜后,用镊子夹住膜,于1x MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗10秒,去除残余 的胶和盐。
9.用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于 UV 交联仪中自动交联。
10.将胶和紫外交联后的膜,在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)
12.将膜在-20℃保存。
7.探针的制备
1.在1.5ml 离心管中配制以下反应液:模板 DNA(25 ng)\t1ul
Random Primer 2ul 灭菌水 11ul 总体积:14ul
2.95 °C 加热3分钟后,迅速放置于冰冷却5min。
3.在离心管中按下列顺序加入以下溶液:
1 0 ×Buff er 2 .5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
4.混匀后(25ul), 3 7°C 下反应30分钟。短暂离心,收集溶液到管底。
5.65 °C 加热5min 使酶失活。
8.探针的纯化及比活性测定:
1.准备凝胶:将1g 凝胶加入30ml 的 DEPC 水中,浸泡过夜。用 DEPC 水洗涤膨胀的凝胶 数次,以除去可溶解的葡聚糖。
2.取1ml 一次性注射器,去除内芯推扞,将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住,在注射器 中装填 Sephadex G-50凝胶。
3.将注射器放入一支15ml 离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g 离心4分钟,凝胶压紧后,补加 Sephadex G-50凝胶悬液,重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml 刻度 处
4.100ul STE 缓冲液洗柱,1600g 离心4min。重复3次。
5.倒掉离心管中的溶液后,将一去盖的1.5ml 离心管置于管中,再将装填了 Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中,注射器口对准1.5ml 离心管。
6.将标记的 DNA 样品加入25 ul STE,取出0.5ul 点样于 DE8\tpaper 上,其余上样于层
析柱上。
保留在层析柱中。取0.5ul 己纯化的探针点样于 DE8-paper.
8. 测比活性。
9.预杂交:
1.将预杂交液在杂交炉中6 8℃预热,并漩涡使未溶解的物质溶解。
2.加入适当的 ULRAhyb 到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb 杂交液 ),42 ℃ 预杂交4 hr。
10.探针变性:
1.用 10 mM EDTA 将探针稀释10倍。
2.90 ℃热处理稀释后探针10min 后,立即放置于冰上5min。
3.短暂离心,将溶液收集到管底。
11.杂交:
1.加入0.5ml ULTRAhyb 到变性的探针中,混匀后,将探针加到预杂交液中。
2.42 ℃杂交过夜(14~24hr)。杂交完后,将杂交液收集起来于-20 ℃保存。
12.洗膜:
1.低严紧性洗膜:加入 Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml 洗 膜溶液),室温下,摇动洗膜5min 两次。
2.高严紧性洗膜: 加入 High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml 洗膜溶液),42 ℃ 摇动洗膜20min 两次。
13.曝光:
1. 将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防止膜干燥。
2. 检查膜上放射性强度,估计曝光时间
3. 将 X 光底片覆盖与膜上,曝光
4. 冲洗 X 光底片,扫描记录结果。
14.去除膜上的探针:将200ml 0.1%SDS(由 DEPC 水配制)煮沸后,将膜放入,室温 下让 SDS 冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后,可以保存几个月。
15.杂交结果 \t
操作应该小心,但不必紧张。用于 RNA 电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去 RNAse 酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡
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