质粒提取试剂配置

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调 pH），氨苄青霉素，卡那 霉素，质粒提取试剂盒 

仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒 1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：

1.  LB 培养基的配制：

在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇 动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 15psi 高 压下蒸汽灭菌 20min.

固态培养基

LB 固体培养基及倒板 ：

（1）.配制：100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉

（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55℃的水浴中，待培 养基温度降到 55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为 50μg/ml），以免温度过 高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于 4℃保存，一个月内使用。

2.  从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

3.  加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30分钟后。

4.  42℃水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。

5. 向管中加入 1ml LB 液体培养基（不含 Amp），混匀后 37℃振荡培养 1 小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。

6. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌 液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养 16-24 小时。

同时做两个对照：

对照组 1： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情 况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

对照组 2： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不 含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

大肠杆菌的扩增

1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3-5ml LB 液体培养基中，37℃下振荡 培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1：100-1：50 的比例接种 于 100ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 ＝0.5 左右。

2.  取上述培养液置于冰中 10min，之后转移到已灭菌的 50ml 离心管中再于冰上放置5min

3.  于 4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌

4.   质粒的提取

准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

5.   质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）

质粒转染细胞株

材料

细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA 消化液、转染试剂（Lipofectamine  TM2000）

实验步骤

Ⅰ.准备细胞：

贴壁细胞：转染前 24 h，在 500 µL 无双抗完全培养基中接种 0.5-2×105 个细胞， 转染时细胞融合度为 80 - 90% 。 ( 注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞 堆积生长。)

II  ．对于每个转染样品，按下面的方法准备：

（1）用 50 µL Opti-MEM 稀释 0.8 µg 质粒 DNA，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下 静置 5 min。

（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 µL Opti-MEM  稀释 2.0 µL   LipofectamineTM2000，轻轻吹吸 3 - 5  次混匀，室温下静置 5  min。

（3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100  µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5）将细胞板置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右。 稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）

从 37℃，5％CO2 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 µg/ml G418 的 新鲜培养基，每  2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到 60%汇合率时再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选一次。当细胞达到 90%以上汇合率时将细 胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10-12 天左右）。以后每隔 4-5 天再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染 后 15 天左右）。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

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