质粒提取说明书

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调 pH），氨苄青霉素，卡那 霉素，质粒提取试剂盒 

仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒 1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：

1.  LB 培养基的配制：

在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇 动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 15psi 高 压下蒸汽灭菌 20min.

固态培养基

LB 固体培养基及倒板 ：

（1）.配制：100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉

（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55℃的水浴中，待培 养基温度降到 55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为 50μg/ml），以免温度过 高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于 4℃保存，一个月内使用。

2.  从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

3.  加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30分钟后。

4.  42℃水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。

5. 向管中加入 1ml LB 液体培养基（不含 Amp），混匀后 37℃振荡培养 1 小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。

6. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌 液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养 16-24 小时。

同时做两个对照：

对照组 1： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情 况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

对照组 2： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不 含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

大肠杆菌的扩增

1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3-5ml LB 液体培养基中，37℃下振荡 培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1：100-1：50 的比例接种 于 100ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 ＝0.5 左右。

2.  取上述培养液置于冰中 10min，之后转移到已灭菌的 50ml 离心管中再于冰上放置5min

3.  于 4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌

4.   质粒的提取

准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

5.   质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）

质粒转染细胞株

材料

细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA 消化液、转染试剂（Lipofectamine  TM2000）

实验步骤

Ⅰ.准备细胞：

贴壁细胞：转染前 24 h，在 500 µL 无双抗完全培养基中接种 0.5-2×105 个细胞， 转染时细胞融合度为 80 - 90% 。 ( 注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞 堆积生长。)

II  ．对于每个转染样品，按下面的方法准备：

（1）用 50 µL Opti-MEM 稀释 0.8 µg 质粒 DNA，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下 静置 5 min。

（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 µL Opti-MEM  稀释 2.0 µL   LipofectamineTM2000，轻轻吹吸 3 - 5  次混匀，室温下静置 5  min。

（3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100  µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5）将细胞板置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右。 稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）

从 37℃，5％CO2 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 µg/ml G418 的 新鲜培养基，每  2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到 60%汇合率时再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选一次。当细胞达到 90%以上汇合率时将细 胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10-12 天左右）。以后每隔 4-5 天再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染 后 15 天左右）。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

马庄顾1710质粒单酶切后怎么抽提DNA?
麻利浅15284376016 ______ 碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析.方法如下: 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基. 2、37℃振荡培养过夜. 3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min...

马庄顾1710质粒DNA经电泳后图上为什么只有两条带 -
麻利浅15284376016 ______ 如果是刚抽出来的质粒,好的只有一条带:超螺旋条带 如果提取裂解步骤过于剧烈,则会出现两条带:超螺旋和开环质粒 有时候会出现三条带:超螺旋、开环质粒和复制中间体

马庄顾1710酵母细胞质粒提取步骤方面的知识哪里能找到? -
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麻利浅15284376016 ______ 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于20℃冰箱中20分钟,然后4℃下12000g离心10分钟

马庄顾1710质粒转化感受态细胞的原理是什么(原理,感 -
麻利浅15284376016 ______ 不对,通过转化到感受态细菌中,不是细胞.感受态的大肠杆菌,可以自己制作也可以通过购买.之后将细菌凃到含有抗生素的板子上,长出克隆后挑取单克隆,将单克隆加入含有抗生素的细菌培养基中培养,之后提取质粒,提取质粒可以购买相应的试剂盒,按照试剂盒的说明书操作即可.质粒是带有抗性基因的,只有含有该质粒的细菌才能在含有对应抗生素的培养基中存活并增殖,这样就能确保是你的表达载体质粒.当然为了防止杂菌的污染,整个过程中最好是无菌操作.而表达载体质粒有可能出现突变等情况,所以可以在提出质粒之后,取少量质粒送测序,来确保序列的无误.

马庄顾1710提取细菌质粒的原理及方法 -
麻利浅15284376016 ______ 提取细菌或是其他原核生物,就可以用,反转录法;如果要提取人或是其他真核生物,就用鸟枪法,因为真核生物基因的编码区不是连续的,有内含子

马庄顾1710如何鉴别一个质粒dna成功转入到大肠杆菌感受态细胞中 -
麻利浅15284376016 ______ 通常使用选择培养基来筛选大肠杆菌.例如重组质粒上带有抗四环素基因,那么使用带有四环素的选择培养基,将待测大肠杆菌接种到选择培养基,只有成功转入重组质粒的大肠杆菌才能在选择培养基生长

马庄顾1710跪求!!博凌科为 的 无内毒素质粒大提试剂盒 的详细说明!谢谢!!!
麻利浅15284376016 ______ 博凌科为的无内毒素质粒大提试剂盒,轻松从大量菌液中最大限度获得转染级质粒 本试剂盒采用独特硅胶膜吸附技术,高效专一地结合质粒DNA.同时采用特殊的去内毒素系统,可有效的去除内毒素、蛋白等杂质,操作简单方便,可同时操作...

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麻利浅15284376016 ______ 生物素化质粒ds-DNA:将含质粒pBR332的大肠杆菌在含氨苄青霉素的LB培养基中扩增,取纯培养物用MagicTM DNA纯化系统,按Promega公司所附操作说明书提取质粒ds-DNA.取纯化的不含单链DNA的大肠杆菌质粒ds-DNA直接与长臂光敏...

马庄顾1710怎样从菌体中克隆目标基因? 怎样把克隆的基因转到质粒上? -
麻利浅15284376016 ______ 1克隆的话只要给予充足的原料和环境,然后刺激进行复制 2用相同的剪切酶在基因和质粒上剪下,因为酶一样,,所以可以把剪下的目标基因接到质粒上,当然需要连接酶的帮助