每一轮pcr循环包括哪几步

1. 如何有效设计引物

（1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。

2. PCR电泳无扩增条带

（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

3. PCR产物量过少

（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。
（4）引物量不足。增加体系中引物含量。
（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

5. 扩增产物出现多条带（杂带）

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。

6. 阴性对照出现条带

（1）试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

7. 条带大小与理论不符

（1）污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
（2）模板或引物使用错误。查看引物是否会扩增部分条带和模板是否正确。
（3）基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

8. 持续出现假性条带

（1）起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的T值相差不大。可尝试适当提高PCR温度或者设置降落PCR，降低循环数。

9. 菌落PCR检测有条带，接种大摇后无条带

（1）可重新以菌落和菌液为模板进行PCR对照检测，因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高。如果仍出现上述结果，推测可能是平板上连接液中的未连接载体的扩增引起的目的条带，进一步质粒PCR检测，可证明目的片段是否真正连接成功。

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