碱裂解法小提质粒原理
柱式质粒提取试剂盒
产品简介:
采用优化的 SDS-碱裂解法裂解细胞,高效去除抑制物等杂质,离心吸附柱内的硅基质膜在
高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA,并最大限度的去除蛋白质、基因
组 DNA、RNA 和其他杂质,最后在低盐、高 pH 的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质
膜上洗脱,每个吸附柱可吸附高达 50μg 的质粒 DNA。纯化的质粒 DNA 可直接用于酶切、
PCR、测序、转化、转染一些常规的传代细胞等生物学实验。
产品内容:
储存条件:
RNase A,-30 ~ -15℃保存,干冰运输;
其他组分 15 ~ 25℃保存,室温运输。
使用步骤:
1、取 5-15 mL 过夜培养菌液加入离心管中,12000 rpm 离心 1 min 收集菌体沉淀,尽量吸弃
上清。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 500 μL Buffer P1(已加入 RNase A),使用移液枪或涡
旋振荡器充分混匀,悬浮菌体沉淀,混匀至无菌块。
3、向离心管中加入 500 μL Buffer P2,温和上下颠倒混匀 4-6 次,充分混匀使菌体裂解,此
时溶液应变得清亮粘稠。
注意:温和地混匀,不要剧烈震荡,以免打断基因组 DNA。所用时间不应超过 5 min,以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入 700 μL Buffer P3,立即温和上下颠倒混匀 8-10 次,充分混匀,此时应出现白色絮状沉淀,12000 rpm 离心 10 min。
注意:P3 加入后立即混合,避免产生局部沉淀。如果离心完仍有沉淀漂浮,可延长离心时间取上清。
5、将步骤 4 中的上清液分批转移到已装入收集管的吸附柱中,12000 rpm 离心 1 min,倒掉
收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:一根吸附柱最大容积为 750 uL,请分两次转移上清液到吸附柱中。
6、向吸附柱中加入 500 μL Buffer PD,12000 rpm 离心 1 min,弃废液。
7、向吸附柱中加入 600 μL Buffer PW(使用前请确认是否加入无水乙醇),12000 rpm 离心
1 min,弃废液。
注意:加入漂洗液 PW 后,室温静置 2-5 min,有助于更好的去除杂质。
8、重复一次步骤 7。
9、将吸附柱重新放回收集管中,12,000 rpm 离心 2 min,目的是去除吸附柱中残余的漂洗液。
注意:乙醇残留会抑制后续的酶反应,建议将吸附柱开盖,置于室温放置数分钟,确保乙醇挥发干净。
10、将吸附柱放到一个干净灭菌 1.5 mL 离心管中,将吸附柱开盖静置数分钟。向吸附膜中
间位置悬空滴加 50-100 µL Buffer TE 或 ddH2O(可提前放在 55 - 65 ℃水浴锅中预热,提高
质粒 DNA 回收率),室温放置 2 min。12,000 rpm ,离心 2 min 收集质粒 DNA 溶液(若需
要获得最高产量,建议将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,重复第 10 步进行二次洗脱。)。
11、质粒溶液保存在- 20℃。
注意事项:
1、使用前请短暂离心 RNase A,将试剂盒提供的 RNase A 溶液全部加入 Buffer P1 中,置于
4℃保存。
2、首次使用前按 Buffer PW 瓶子标签所示,加入适量的无水乙醇稀释 Buffer PW,于室温保
存。
3、若低温保存时,Buffer P2、Buffer P3 和 Buffer PD 溶液容易产生白色沉淀,使用前可室
温放置一段时间,必要时可在 37℃水浴锅中预热至沉淀完全溶解,混匀后再使用。
4、Buffer PD 可以有效去除残留的蛋白污染,当宿主菌为 endA+(TG1、BL21、HB101、ET12567、
JM 系列)等核酸酶含量较高的菌株时,必须使用 Buffer PD。
5、处理低拷贝质粒时,提高菌液的用量,并按比例扩大 Buffer P1、Buffer P2 和 Buffer P3
的用量。
6、使用 Buffer P2、Buffer P3 和 Buffer PD 应戴手套,使用后应立即盖紧盖子。
7、自备试剂:乙醇。
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