质粒单酶切

固安县城科技大道与江山路交口西北角，一座座砖红色的欧式小楼掩映在绿树丛中——这里是固安肽谷生物医药产业园（以下简称肽谷）。

北京研发，廊坊孵化转化。抢抓京津冀协同发展机遇，固安县充分发挥自身区位优势，吸引中小型创业团队和科研机构落户，打造以生物医药研发为主导的生命健康产业集群。

肽谷成立于2013年，是以治疗性疫苗、多肽蛋白质药物、体外诊断试剂等为发展重点的专业科技企业产业园，已建成2.2万平方米生物医药孵化基地，2018年被认定为国家级科技企业孵化器，目前入驻企业41家。

■ “拎包入住”，打造共享服务平台

7月16日，在德阳生物技术（固安）有限责任公司（以下简称德阳生物）的开放实验室里，工作人员正在对一个个制剂样本进行电泳实验，这些制剂即将被罐装生产，进入临床II期试验阶段。

“重大突破！这是公司成立之初就启动研发的一种蛋白质新药，主要治疗免疫力缺乏病人慢性诺如病毒感染，目前已在美国完成临床Ia试验。”该公司财务总监孙赫彤介绍。

德阳生物的创始人刘宏宇博士，曾在美国和欧洲知名制药公司担任研发高管，回国后联合多位国内外专家在北京组建了生物医药研发团队。

投资大、周期长、高风险——研发生物创新药的路上，有很多“拦路虎”。而与肽谷的相遇，让刘宏宇创业的信心足了。

肽谷建设的生物医药公共技术服务平台，拥有生物医药研发用的各类科研仪器设备，为企业提供仪器租赁、样品检测、技术支持及项目开发服务。

2013年4月，德阳生物固安团队入驻肽谷，成为第一个入园企业。

“园区的公共实验设备很多，我们只购买了少量仪器，搬进楼第一天就直接通上电源调试。”许多老员工回忆，公司入驻这个“新家”很从容，是真正的“拎包入住”。

625平方米的办公空间，上下两层，入驻前三年租金全免——对于初创阶段的德阳生物来说，肽谷的支持无疑是“雪中送炭”。

三年疫情是一道坎。“资金周转困难的时候，园区对房租、物业费给予延期宽限的照顾，与企业共克时艰。”孙赫彤感慨地说。

■ 突破卡点，研发多种免疫治疗新药

转动移液枪的旋钮，调至合适的量程，将样品加入十几个EP管中……7月7日上午，在固安鼎泰海规生物科技有限公司（以下简称鼎泰海规）实验室里，技术研发部研发工程师刘亚超开始了他的酶切实验。

“质粒是环状的，需要找两个酶切位点，单酶切后成为链状，双酶切后就变成了两个片段……”刘亚超在纸上为我们画出一个圆环，用笔标示出酶切的位置。

刘亚超口中的质粒，是鼎泰海规自主研发的一款DNA分子新药，也是国内第一个申请临床批件的肿瘤治疗性DNA疫苗。

2014年落户肽谷的鼎泰海规，是北京震旦鼎泰生物科技有限公司的全资子公司，致力于新一代DNA疫苗药物研发。

在外行人的眼中，实验室的工作画面似乎总是重复的——制作标本、试管取液、观测数据……而事实上，每个环节都是独一无二的，时间、剂量、反应条件要分毫不差。

“构建原始材料的过程中，需要把提供的DNA片段像缝衣服一样，剪掉不要的，再把需要的拼接起来，要不断挑选、重试……”该公司研发部主管宋卫卫说，仅这一个环节起初就要反复摸索一个月才成。

无数次的失败为成功铺平了道路，每一步都如此。

治疗肿瘤最大的难点，在于如何把DNA疫苗运送到细胞里。“构建好的质粒过大，很难导入到真核细胞里，要用一种进口的化学转染试剂，我们曾在这个环节卡了半年。”宋卫卫介绍，他们把各种能想到的条件试遍，才找到了问题症结。

与其他疫苗相比，DNA疫苗制备周期短，无需冷藏，适合大量储备。“我们从2016年开始研发这款疫苗，主要用于治疗黑色素瘤、乳腺癌、淋巴癌等实体瘤，今年初获得临床试验批准，顺利的话有望3至5年面市。”宋卫卫说，“公司目前研发管线涵盖多种抗肿瘤、慢性病毒感染等疾病的免疫治疗新药，希望为国家DNA疫苗行业整体水平的提高作贡献！”

■ “拼团”实验，推进产业集聚共同成长

创立于2011年的北京博迈德生物基因技术有限公司（以下简称博迈德），此前已在北京搬过3次家，直到2015年入驻肽谷，才安定下来。

“固安离北京很近，在这里方便整合京津冀的资源和市场。”该公司总经理吴立群初见肽谷，就决定扎下根来。

走进博迈德生物DNA测序室里，上百个样品依次加入测序仪中，电脑上生成彩色线条的波状图。“我们提供专业的DNA测序、DNA合成、分子生物学试剂等技术产品服务。”吴立群介绍。

在肽谷，多数企业都和博迈德打过交道。“我们的产品可为生物医药企业提供实验原料，园区里多家企业都从这里拿货，光物流成本就节省了不少。”吴立群说。

搬来园区后，很多邻居都是老相识，这也是吴立群更看重园区的地方——软件环境、配套服务、产业集聚对初创药企至关重要。

“有需要磷酸氢二钠的可以来取。”“谁家需要干冰，我这里有剩余的。”……在吴立群的手机微信里，“肽谷园区沟通群”是个长期活跃的群组。“共享资源、互通有无，远亲不如近邻。”吴立群说。

肽谷内价值不菲的大量公共实验设备，所有入孵创业企业均能无偿使用。在某些小规模的实验操作中，各企业会“拼团”使用器材设备。“譬如灭菌锅，一个瓶子灭菌也要启动一次，所以我就约2至3个企业一起灭菌。”吴立群说。

得益于肽谷的生物医药产业集聚效应，博迈德快速成长，实现了小规模生产到大规模量产的跨越，目前正在申报廊坊市研发平台。

“从开始十几人的研发团队迁入，到所有工作人员、设备仪器的整体搬迁，博迈德在固安的生产规模已是北京初创期的近十倍。”吴立群说，他们将建设新厂房，进一步扩大生产，与园区共同成长。（河北日报记者 解丽达 周禹佳 通讯员 肖靖凯）

庾亨敬3133质粒和目的基因能用同种限制酶切吗? 会不会自连? -
厉承狗19364547698 ______ 质粒用一种内切酶切会自连的,所以一般做克隆进来避免用单酶切.如果没有办法,只能用单酶切,最好对质粒进行碱性磷酸酶处理,去磷,这样能够降低自连的比例,增加克隆成功的概率.目的基因单酶切一般不会自连的.

庾亨敬3133很大的质粒如何酶切连接,如载体13k,片段3k -
厉承狗19364547698 ______[答案] 这也不算大,就将充分酶切载体和片段按mol比为1:3-10连接,载体100ng以上,单酶切载体请去磷酸

庾亨敬3133单酶切怎么把dna片段切出来 -
厉承狗19364547698 ______ 如果你的质粒上在不同位置有两个相同的酶切位点,单酶切也可以切出两条带啊.第二个问题,你要看看PCR扩增出的片段中有没有酶切位点,不一定一对引物都要带酶切位点.

庾亨敬3133一个质粒和一个目的基因,上面都有两种酶的切割位点,为什么用一种酶切后,再连接,有三种连接产物,而... -
厉承狗19364547698 ______ 单酶切来做连接无法选择目的片断插入的方向,插入产物有正反向两种.单酶切载体也很容易产生自连(所以单酶切为了防止自连常用ciap处理) 不同酶的双酶切做连接可以保证插入方向性,也能防止自连,理论产物只有一种

庾亨敬3133质粒电泳通常有多条色带,怎样证明其是同一分子 -
厉承狗19364547698 ______[答案] 质粒电泳的多条带是质粒分子不同的构型(超螺旋、开环、线性),因此,要证明其是同一分子,只需要用一种酶做单酶切,如果能获得单一的条带,那么就证明是同一分子了.

庾亨敬3133质粒中导入的片段无法酶切取出
厉承狗19364547698 ______ 第一,没有切开,设单酶切对照,确保两个酶都能起作用 第二,质粒质量不好,导致切不开,可以试剂盒纯化 第三,质粒量要控制好,不能太多,太多切不开;也不能太少,太少切开了也看不到 第四,PCR存在假阳性、假阴性的可能.

庾亨敬3133请大侠赐教:什么时候用单酶切,什么时候用双酶切?我看文献时是目的基因先与一个质粒载体连接(用一种酶消化后连接),然后再用两种酶切下这段目的... -
厉承狗19364547698 ______[答案] 构建就是个过程嘛 最后能搞出那个质粒 不管你用什么方法都无所谓啦 管他单切双切的

庾亨敬3133怎么对提取质粒进行鉴定? -
厉承狗19364547698 ______ 首先跑一个琼脂糖凝胶电泳,观察一下带型和大小是否符合,然后根据质粒所含有的酶切位点,选择合适的限制性内切酶进行单酶切或双酶切,观察酶切后的条带数和大小是否与理论一致.

庾亨敬3133双酶切好还是分步酶切好 -
厉承狗19364547698 ______[答案] 两种酶的restriction buffer一样的话,就双酶切;如果不一样,那就没办法了,只能分步酶切.