质粒sirna共转染

本篇文章作者发表在iScience 期刊，IF为5.8。该研究利用Turbo ID邻近蛋白标记技术，构建一种能有效筛选与HBV核心启动子序列相互作用宿主因子的方法。利用该方法筛选和鉴定出HBV转录相关因子STAU1，进而解析STAU1调控HBV复制的具体机制。

前言：

乙型肝炎病毒（HBV）的核心启动子（CP）通过控制基因组前RNA（pgRNA）的转录对HBV复制至关重要。调节CP活性的宿主因子可以通过不同的方法识别。基于生物素的邻近标记是一种能够捕获弱或动态相互作用的强大方法，尚未用于绘制与CP相互作用的蛋白质。本研究作者通过优化TurboID邻近蛋白标记技术，建立了一种新的HBV转录相关因子的筛选系统，利用该系统，作者将STAU1确定为参与HBV CP调节的重要因素。在机制上，STAU1间接结合由TARDBP介导的CP，并将SAGA转录共激活因子复合物招募到CP中以上调其活性。此外，STAU1与HBX结合，并通过以泛素非依赖性方式稳定HBX来提高HBX的水平。

研究思路:

研究结果：

构建基于TurboID邻近标记技术的HBV转录相关因子筛选系统

为利用 TurboID技术标记与HBV核心启动子序列结合的宿主因子，作者采用两对具有高亲和力的分子对，即四环素转录激活蛋白（tTa）和四环素反应元件序列（TRE）、 Rapamycin 介导FK506结合蛋白12（FKBP12）和FKBP12-Rapamycin 结合蛋白（FRB）。其工作原理如图1A和1B所示，将 tTA与FRB 融合，TurboID与FKBP12融合。在Rapamycin存在的情况下，融合蛋白FRB-tTA可将融合蛋白 FKBP12-TurboID 招募至HBV核心启动子序列旁的TRE上。此时，在生物素存在的情况下，TurboID可对结合到HBV核心启动子上的宿主因子进行生物素化标记。在无Rapamycin存在时，FKBP12-TurboID虽不能被招募到FRB-tTA结合的TRE附近，但其在生物素存在的情况下，仍然可以标记其邻近的蛋白分子，因此可以作为一种空间参照，用于排除非特异性标记的蛋白质。利用链霉亲和素磁珠纯化出被生物素标记的蛋白质，再进行质谱分析与鉴定。

此外，为减少非特异性标记，作者首先对该系统外源性Biotin的作用浓度和时间进行优化。根据结果，生物素化蛋白质的水平随着孵育时间和生物素浓度的增加而逐渐增加（图1C）因此，确认最终生物素浓度0.5mM和1h孵育时间。之后，优化Rapamycin作用浓度和时间，将3flag-tTa-FRB质粒和FKBP12-TurboID质粒共转染到HepG2细胞中，然后用Rapamycin（200nM）处理细胞不同时间，长达48h。用生物素（0.5mM）处理1h后，使用链霉亲和素珠捕获被生物素修饰的3flag-tTa-FRB融合蛋白，通过Western blot检测该蛋白的含量。结果表明，Rapamycin的生物素化3flag-tTa-FRB水平随着孵育时间的增加而增加。值得注意的是，增加在12h后明显，并在36h后达到峰值（图1D）。因此，该研究在随后的实验中选择200nM Rapamycin并治疗12h。

为了进一步评估该系统，用pTER-PCORE，p2flag-tTa-FRB，pFKBP3-TurboID，生物素化TRE片段或生物素化对照片段（图1E）链霉亲和素磁珠下拉实验和蛋白质印迹显示，3flag-tTa-FRB的生物素化同时受外源性生物素和Rapamycin的调控。此外，3flag-tTa-FRB可以被生物素化的TRE序列拉下，但不能被对照序列拉下。因此，这些结果表明，FKBP3-TurboID主要通过添加的生物素对flag12-tTa-FRB进行生物素化。结果还表明，3flag-tTa-FRB可以与TRE序列结合。

利用TurboID 邻近标记系统筛选并鉴定HBV转录相关因子

为了鉴定HBV转录相关因子，作者将质粒pTRE-PCORE，p3flag-tTa-FRB和pFKBP12-TurboID共转染到HepG2细胞中。用200nM雷帕霉素处理细胞12h或不（作为对照），如图2A将生物素（0.5mM）加入培养基中以在裂解前1h开始标记。使用链霉亲和素珠从裂解物中富集生物素化的蛋白质，然后进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。在对照组和Rapamycin处理组取交集，鉴定出42种蛋白质（图2B和2C）。作者试图克隆这42个基因，只成功了19个基因。为测试这19种基因对HBV核心启动子的影响，作者将表达这些基因的质粒分别与HBV核心启动子驱动的海肾荧光素酶报告基因质粒（pPCore-Rluc）共转染HepG2细胞。荧光素酶实验结果显示过表达SEC61B，STAU1，ATP5F1，RPL36，CHAMP1和GRWD1可增加HBV核心启动子活性（图2D）。此外，将19个基因质粒与HBV1.3质粒共转染到HepG2细胞中，并通过Southern印迹分析HBV DNA的复制。与报告基因测定一致，五个基因（SEC61B，STAU1，RPL36，CHAMP1和GRWD1）增强了细胞内HBV DNA复制水平（图S1 A），重复测定显示STAU1增加HBV复制最多（图S1B-S1E）。因此，进一步的研究主要集中在STAU1上。

STAU1调控HBV DNA和RNA水平

为了分析STAU1过表达对HBV复制的影响，作者将表达STAU1的质粒与HBV1.3共转染到细胞中。通过RT-PCR和蛋白质印迹验证了STAU1的过表达（图3A和3B）。Southern blot 显示，随着STAU1表达质粒量的增加，细胞内HBV DNA复制水平增加（图3C和3F）。STAU1的过表达也以剂量依赖性方式增加了培养基中的HBsAg和HBeAg水平（图3D和3G）。Northern blot显示，STAU1 梯度表达可使 HBV RNA 水平逐渐增强（图3E和3H）。为了评估STAU1敲低对HBV复制的影响，作者合成了用胆固醇修饰的siRNA对抗STAU1。通过RT-qPCR和Western blot验证该siRNA的敲低效率，si-STAU1可在肝癌细胞中显著敲低STAU1 的表达（图3I和3J）。并且敲低STAU1分别抑制HepG2和Huh7细胞中HBV DNA，HBsAg，HBeAg和HBV RNA的水平（图3K-3P）。

为了进一步证实STAU1的作用，作者以HepG2-NTCP细胞为基础，构建了过表达和敲除STAU1的稳定细胞系。结果显示，与对照组相比，过表达STAU1的细胞系的HBV复制明显增加；另一方面，在STAU1敲除的稳定系中，HBV复制被显著抑制（图3Q-3S）。作者进一步分析了STAU1对HBV cccDNA的影响。如图3T所示，过表达STAU1显著提高了cccDNA的转录活性，STAU1的敲除显著降低了cccDNA的转录活性，但对其水平均没有影响。这些结果进一步表明，STAU1通过增强cccDNA的转录来促进HBV的复制。

STAU1间接与CP结合

前期研究结果显示，STAU1可能通过调控HBV核心启动子活性从而调节HBV复制。为了验证这一假设，作者将STAU1质粒或STAU1靶向siRNA与核心启动子报告基因（pPcore-Rluc）共转染。正如预期的那样（图4A和4B），STAU1过表达增加了荧光素酶活性，而STAU1敲低降低了荧光素酶活性。作者还评估了STAU1是否激活其他HBV启动子（preS1，pre2和X启动子），发现STAU1过表达对这些启动子没有显着影响（图4G）。

为了鉴定STAU1对CP影响所需的结构域，作者构建了五个缺失突变体（图4D），RBD3或RBD4结构域的缺失消除了STAU1对CP活性的影响，表明这两个结构域对其作用至关重要。为了鉴定HBV CP中与STAU1相互作用所必需的区域，作者创建了表达不同CP区域（图4E）并进行荧光素酶测定。研究结果表明，STAU1可能主要通过与CP区域1,451-1,850（图4F）。

STAU1激活CP表明它可能直接或间接地与CP结合。因此，作者用ChIP测试了这一假设。将p3flag-STAU1质粒分别转染进HepG2-pCore-Gluc稳定细胞系和HepAD38细胞。利用Anti-Flag和IgG免疫沉淀，并通过qPCR检测。结果表明，在HepAD38和HepG2-pCore-Gluc细胞中，与IgG对照相比，HBV CP序列被Flag抗体富集（图4H和4I），表明STAU1与CP结合。为了观察 STAU1是否与游离体CP序列结合，作者将质粒3flag-STAU1 和HBV1.3共转染到HepG2细胞中并进行ChIP实验。研究结果表明，STAU1和游离体CP具有相互作用（图4J）。

为了测试STAU1是否直接与CP结合，作者使用从大肠杆菌表达的重组STAU1和覆盖CP序列（HBV 1,450-1,850）的7个生物素标记探针进行了电泳迁移率转移测定（EMSA），HNF4α作为阳性对照。然而，在STAU1组中未观察到电泳位移带，表明STAU1不直接与HBV CP序列结合（图4K-4N）。

STAU1通过与TARDBP相互作用间接结合CP

文献报道，STAU1与TARDBP相互作用；TARDBP与HBV CP结合。作者推测STAU1与CP的结合可能由TARDBP介导。为了验证这一假设，通过基于三分段Nanoluc荧光素酶的蛋白质相互作用测定分析了STAU1和TARDBP之间的相互作用（图5A）。将质粒共转染到HepG2细胞中，48 h后测定荧光素酶活性。与对照组（HBx和DDB1突变体）相比，野生型HBx和DDB1有效地恢复了Nanoluc荧光素酶活性，产生的发光信号比对照组高约200倍（图5B）。接下来，该系统用于探测STAU1和TARDBP之间的相互作用。结果显示，与对照组比，STAU1和TARDBP之间相互作用可使荧光素酶信号增加约26倍。此外，免疫共沉淀（co-IP）实验也证实了STAU1和TARDBP之间的相互作用（图5C -5E）。

接下来，作者验证TARDBP是否可以介导STAU1与CP的结合。首先通过原核表达并纯化出STAU1和TARDBP重组蛋白 （图5F）。通过EMSA实验分析STAU1、TARBDP和HBV CP序列之间的相互作用。TARDBP与HBV CP相互作用形成电泳迁移带，而STAU1不直接与HBV CP结合；当STAU1和TARDBP同时存在时，加入STAU1抗体后形成电泳超迁移带（图5G）。因此，TARDBP介导STAU1与HBV CP的结合。

为了进一步探索TARDBP在STAU1对HBV复制的影响中的作用，设计并验证了一种靶向TARDBP的siRNA（图5H和5I）。在siRNA存在下，STAU1过表达对HBV CP活性和HBV复制的影响显著降低甚至消失（图5J-5L），表明TARDBP在STAU1介导的HBV复制效应中起重要作用。

STAU1招募SAGA转录共激活因子复合物

为了分析STAU1激活CP转录的机制，作者首先通过质谱鉴定STAU1的互作蛋白。在检测到的蛋白质中，仅在样品组中鉴定出404种（图6A）。在这些蛋白质中，HAT1、TAF10和SPUT20属于SAGA转录共激活复合体，这是涉及RNA聚合酶II的转录调控所必需的。作者推测STAU1可能会将SAGA转录共激活因子复合物募集到CP附近以激活HBV转录。为了验证这一假设，使用三分段Nanoluc系统评估STAU1与HAT1或TAF10或SPUT20之间的相互作用。如图6B，N8-HAT1和N8-TAF10加上STAU1产生的发光信号比对照组的发光信号大20倍以上。然而，N8-SPUT20并没有恢复Nanoluc活性。co-IP实验进一步证实了STAU1和HAT1以及STAU1和TAF10之间的相互作用（图6C和6D）。这些数据支持STAU1将SAGA转录辅激活复合物募集到CP的观点。

接下来，作者分析了SAGA在STAU1激活HBV复制中的作用。SAGA复合组分（HAT1/TAF10/SPUT20）的过表达显著提高了HBV CP活性和HBV复制，然而，当STAU1被干扰时，SAGA复合体的影响消失了（图6E–6G）。进一步研究了TARDBP与SAGA综合体之间的关系。TARDBP敲低逆转了SAGA复合物对HBV复制的影响（图6H-6J），这种现象类似于在STAU1敲低实验中观察到的现象。综上所述，这些数据表明SAGA复合物与STAU1相互作用以影响HBV复制。

STAU1与HBx相互作用并增强其稳定性

STAU1通过与病毒蛋白相互作用，促进了多种病毒的复制，例如HIV，HCV和埃博拉病毒。为了验证STAU1是否与HBV病毒蛋白相互作用以促进HBV复制。作者利用三分段Nanoluc测定法检测了STAU1与HBV的4种病毒蛋白（包括Core蛋白，pol蛋白，S蛋白和X蛋白）之间的相互作用。结果显示，与对照组比，四种蛋白中只有HBX与STAU1相互作用（图7A）。此外，通过co-IP也证实STAU1和HBx之间的相互作用（图7B）。

为了确定与HBX相互作用所需的STAU1的结构域，作者构建了5个突变体，并进行了三分段Nanoluc测定。如图7E所示，TBD或RBD5结构域的缺失部分降低了发光信号。RBD3或RBD4结构域的去除完全破坏了相互作用。与野生型STAU1相比，STAU1 RBD2结构域的缺失使发光信号显著提高了约2倍。根据这些结果，IP实验表明，RBD3或RBD4结构域的缺失削弱了相互作用（图7C）。同样，STAU1 RBD2结构域的缺失显著增加了HA-HBX共沉淀的量。这些结果表明，RBD3和RBD4对于STAU1与HBX的相互作用是必要的，而RBD2以某种方式抑制了其相互作用。

为了确定HBX中与STAU1相互作用所需的区域，作者构建了一系列表达HBX突变体的质粒，并进行了三分段Nanoluc测定。如图7F所示，HBX1-30aa（氨基酸）的缺失对STAU1与HBX的相互作用没有影响。HBX91-120aa的缺失部分降低了其与STAU1的相互作用。当HBX 31-60aa、61-90aa或121-154区段缺失时，发光信号被完全消除。通过IP实验也得到了类似的结果（图7D）。这些结果表明，HBX 31-60、61-90和121-154 区段对HBX与STAU1的相互作用至关重要。

接下来，作者验证STAU1在与HBX结合对HBX的影响。WB结果表明，过表达STAU1增加了HBX的蛋白水平，敲低STAU1显著降低了HBX蛋白水平（图7G和7H）。HBX水平的变化不能用HBX mRNA水平的变化来解释（图7I和7J）。

为研究STAU1是否通过影响HBX蛋白稳定性调控HBX表达，作者首先检测STAU1对HBX 半衰期的影响。将HBX分别与STAU1或者对照质粒共转染HepG2和Huh7细胞，转染48h后，在不同时间节点加入200μg/ml蛋白质合成抑制剂CHX（Cycloheximide）处理细胞。结果显示，STAU1的过表达延长了HBx的半衰期（图8A和8B），而STAU1的敲低降低了半衰期（图8C和8D）。这些结果表明，STAU1增强了HBX的稳定性。

为了研究HBX在STAU1对HBV复制的影响中的作用，作者共转染了STAU1和HBV1.1质粒或HBV1.1-ΔHBX质粒（图8E）。结果表明，STAU1过表达增强了HBV1.1的HBV复制，但不会增强HBV1.1-ΔHBX的HBV复制（图8F-8H）。相反，STAU1 敲除只能抑制HBV 1.1的 HBV复制，而不能抑制HBV1.1-ΔHBX的HBV复制（图8I-8K）。这些发现表明，HBX在STAU1 对HBV复制的影响中起作用。进一步研究在有无HBX的情况下STAU1对Smc5的影响，因为HBX可通过促进限制性因子Smc5 / 6的降解来促进HBV转录。与之前的报道一致，HBX过表达和HBV1.1转染都降低Smc5的水平（图 S2A-S2D）。过表达STAU1会进一步降低Smc5 的水平（图S2A和S2C），而敲除STAU1则可恢复其水平（图S2B和S2D）。然而，在没有HBX的情况下 过表达或敲除STAU1对Smc5水平没有影响（图S2E和S2F）。这些结果证实，STAU1通过HBX调节Smc5水平。

STAU1抑制蛋白酶体介导的HBX降解。

有研究显示HBX可以通过泛素依赖-蛋白酶体途径降解。为了探索STAU1介导HBX稳定的机制是否通过抑制蛋白酶体途径，作者将p3HA-HBx和pSTAU1质粒或siRNA-STAU1转染到HepG2和Huh7细胞中，之后并用MG132再处理。结果表明，MG132处理减弱了STAU1过表达对HBX的影响（图9A和9C）并逆转了STAU1敲低对HBX的影响（图9B和9D）。此外，进行泛素化测定以确定STAU1是否影响HBX的泛素化。如图9E-9H，STAU1的过表达和敲低均未显著改变HBX的泛素化水平。这表明泛素化机制不参与STAU1介导的HBX稳定性。

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