固定化原生质体的方法

转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转 染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生 物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例； 化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的 技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染 技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目 前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复 杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转 染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件 进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染 方法的操作细节，都需要考虑。

一、细胞传代

1. 试验准备：200ul/1mlTip 头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管 架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

2. 弃掉培养皿中的培养基，用 1ml 的 PBS 溶液洗涤两次。

3. 用 Tip 头加入 1ml Trypsin 液，消化 1 分钟(37℃，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察 到细胞完全从壁上脱落下来为止。

4.  加入 1ml 的含血清培养基终止反应。

5.  用 Tip 头多次吹吸，使细胞完全分散开。

6. 将培养液装入离心管中，1000rpm 离心 5min。

7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择 0.8X106 个细胞加入一个 35mm 培养皿。

8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

9. 将培养皿转入 CO2 培养箱中培养，第二天转染。

二、细胞转染

1. 转染试剂的准备

① 将 400ul 去核酸酶水加入管中，震荡 10 秒钟，溶解脂状物。

②  震荡后将试剂放在－20 摄氏度保存，使用前还需震荡。

2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA 质量)来转染细胞。在一个转染管 中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震荡后在加 入合适体积的转染试剂，再次震荡。

3.  将混合液在室温放置 10―15 分钟。

4. 吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。

5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 24－48 小 时。

三、第二次细胞传代

1.  在转染后 24 小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X105 个细胞/35mm 培养皿将细胞重 新转入培养皿中。

3. 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。

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