电泳条带不明显的原因

       文丨初八没烦恼
       编辑丨初八没烦恼


       辣椒是一种茄科辣椒属植物，它是我国种植面积第一的蔬菜，也是国家冬季蔬菜基地的第一大蔬菜，辣椒作为一类在日常生活中不可或缺的调味品。
       每年的种植面积和产量都位居世界第一，
       海南蔬菜
       种植面积约2.67×105hm2，其中冬季辣椒约4.67×104hm2，在海南蔬菜种植中排在首位。


       而海南省保亭县什玲镇界村的种植作物以辣椒为重，在
       辣椒病害
       中以辣椒青枯病最为严重，辣椒青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种破坏性极强、入侵寄主极快的土传病害之一。
       因其毒性强、寄主范围广泛和生存力强而闻名，甚至在水体和湿润的土壤中也可以长期生存，因此青枯病的防治存在诸多困难。


       青枯菌
       青枯菌
       附着在土壤中的寄主病残体上越冬，在无寄主的情况下它的生存能力也很顽强，可在土壤中存活1~6年之久，病菌通过水流、地下害虫、农用器具等途径传播。
       多从扎根在土壤中的根部或茎基部皮孔和伤口侵入，病菌前期不致病，条件适宜时经寄主根部侵入其运输组织，产生大量胞外多糖导致运输组织堵塞。


       渐渐寄主枯死，
       同时青枯菌还向细胞外分泌多种细胞壁降解酶，这些酶可能也在破坏导管组织引起植株枯萎死亡方面有重要作用。
       青枯病是世界上热带、亚热带和其他暖温带地区最重要和
       最具破坏性的植物疾病之一
       ，目前由于温室效应，导致全球气温的不断升高。


       青枯菌有向更高纬度范围扩散的趋势，青枯菌的植物寄主范围逐渐扩大——多达310种植物，40多个植物科属。
       例如茄科和豆科等
       双子草本植物
       ，桑树、桉树等双子叶木本植物以及香蕉和生姜等单子叶植物，青枯病对于辣椒产量影响很大，因此防治辣椒青枯病刻不容缓。


       辣椒是中国冬季蔬菜基地的第一大蔬菜，
       青枯病
       作为辣椒病害中最为严重的土传病害之一，严重制约着辣椒产量和品质的提升。
       因此本试验以青枯菌RS03为研究对象，对其宿主进行表型观察并对RS03进行分子鉴定，以期探寻青枯菌RS03对辣椒的致病机理并鉴定其生化型和演化型。


       为辣椒青枯病的防治提供理论参考，研究通过解剖观察感
       病辣椒的根、茎
       发现，辣椒青枯雷尔氏病菌主要通过侵入寄主的运输系统，致使导管堵塞并破坏整个导管。
       最终降低了植物的吸水能力致使植物失水死亡，对其进行了16SrRNA、生化型和演化型的鉴定，通过RS03对三种双糖和三种糖醇的利用情况，鉴定其为非标准型生化型。


       通过复合PCR对RS03进行演化型的鉴定，得到了分别为280和144bp的两条特异性条带，由此该菌株属于系统型Ⅰ，
       即亚洲分支菌株。
       本试验揭示了青枯菌主要通过破坏辣椒运输系统致使其失水死亡的致病机理，并确定了青枯菌RS03为非标准生化型。


       并属于系统型Ⅰ即亚洲分支菌株，结果为辣椒青枯病的防治研究提供了理论参考，青枯菌生长缓慢，24h在培养基上看不到它的生长状态，36h后可以看到他的菌落。
       菌落为特征不明显的小菌落，48h菌落生长良好，菌落特征：中心为粉红色，边缘白色，流动性且有光泽，判定该
       菌落为有毒菌株。


       供试菌株RS03病原菌的分离
       通过在油镜下的观察，可以清楚地看到青枯雷尔氏菌被染成红色，属于革兰氏阴性菌，青枯菌呈长椭圆形，菌体为短棒状，菌体长度0.5~1.5m。
       具有运动性
       ，
       革兰氏阴性菌，属原核生物界，变形菌门，β-变形菌纲，伯克氏菌科，雷尔氏菌属。


       以RS03菌株的基因组DNA为模板进行16SrRNA的PCR扩增，采用青枯菌的16SrRNA的引物，根据1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示。
       得到了一条300bp左右的条带，条带大小正确，
       PCR产物送去测序，得到的结果条带一致，解剖健康、
       感病辣椒的茎秆
       ，对比健康辣椒的茎基部的横切面。


       感病辣椒的维管束变褐，从皮层向髓部坏死，横切面的颜色与健康辣椒的横切面相比颜色较深，呈灰褐色。
       对比健康辣椒的茎基部的纵切面，感病辣椒的
       维管束变褐
       ，其余部分也比健康辣椒的茎秆颜色深。


       健康辣椒的根毛非常茂密，有很强的吸收能力，可以源源不断的输送水和营养物质，保证辣椒的正常生长，且健康根及根毛呈现土黄色。
       感染青枯菌的辣椒的根毛逐渐退化，根毛稀少，严重的只剩下主根，根部发褐，阻碍辣椒吸收水和营养物质，使得辣椒吸收不了
       足够的水分而死亡
       。


       根据对三种双糖和三种糖醇的利用情况，将供试菌株RS03进行了生化型的划分，溴百里酚蓝作为PH的指示剂，当呈碱性时，
       呈现蓝绿色
       。
       青枯菌会与这三种双糖和三种糖醇发生反应并产生酸性物质，致使pH值降低到6.0以下时，这时颜色由蓝绿色变为黄色。


       对青枯菌生化型的划分，RS03不能利用
       半乳糖醇
       ，可以利用其余的双糖和糖醇，青枯菌RS03对双糖和糖醇的使用率不同，纤维二糖和乳糖是最先使用的。
       其次是山梨糖醇，麦芽糖和甘露醇是使用最慢的，半乳糖醇无使用情况，这表明菌株RS03为非标准型生化型。


       植物根际土壤中存在着大量的
       有益菌和有害菌
       ，有益菌具有如提高植物抗病能力，促进植物生长，和维持土壤微生态平衡的积极作用，有害菌对作物则具有诸多消极作用。
       如青枯雷尔氏菌对茄科作物有严重的减产效应，青枯菌通过植株的伤口和皮孔侵入，在木质部维管束内迅速生长繁殖并延导管向上扩展，致使导管堵塞，破坏整个导管。


       青枯菌种复合体
       使植物吸收不到水分而死亡，从而导致作物减产，给农民带来经济损失，由于各地环境的差异，导致青枯菌也在不断地进化，在进化过程中演化出不同的生理分化和菌系多样性。
       因此对RS03进行了分子鉴定，目前
       青枯菌
       根据系统类型和序列进行分类，被称为青枯菌种复合体，复合体被分为四种系统类型，每个系统类型应于一个不同的地理区域。


       系统型
       Ⅰ
       在亚洲，系统型
       Ⅱ
       在美洲，
       Ⅲ型
       在非洲，系统型
       Ⅳ
       在日本、澳大利亚及印尼地区，本研究采用演化型复合PCR检测体系对RS03进行了演化型划分。
       结果表明，RS03属于演化型Ⅰ，即亚洲分支菌株，首次根据青枯菌对三种双糖和三种糖醇等六种化合物的利用情况，将供试的青枯病菌
       分为四个生化型
       ，生化型Ⅰ不能利用六种化合物。


       生化型
       Ⅱ利用三种糖而不利用三种糖醇，生化型Ⅲ能利用六种化合物，生化型Ⅳ能利用三种糖醇而不能利用三种糖。
       中国自80年代以来，就有四个生化型不同的生化型的研究，而本试验的供试菌株
       RS03不能利用半乳糖醇，可以利用其余的
       双糖和糖醇。
       这表明菌株RS03为非标准型生化型，对供试菌株RS03进行鉴定确定了RS03属于演化型Ⅰ，即亚洲分支菌株，并且菌株RS03为非标准型生化型。
       该结果完善了辣椒青枯病的研究，为后续对辣椒青枯病的防治工作提供了理论参考，自于海南省保亭县什玲镇界村的
       疑似辣椒病株。


       从海南省保亭县什玲镇界村的疑似辣椒病株中所提取出来，
       采用平板划线法对病原菌进行分离、纯化，用剪刀将病组织剪成1cm左右的组织块备好。
       在超净台先用
       无菌水
       将组织块表面进行清洗，洗去多余的污垢，然后用75%的酒精消毒浸泡1min，再接着用2%的次氯酸钠浸泡3min。


       接着用无菌水清洗三遍，洗去残留的次氯酸钠，以免影响细菌的生长，将组织块剪成细条状，在无菌水中浸泡1h，提前备好TTC固体培养基。
       采用梯度稀释法对菌液进行稀释，从
       不同浓度的菌液
       中取50μL菌液进行涂板，涂板后静置一会，让菌液更好的渗透进平板中，48h进行观察。


       革兰氏染色法
       一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体的染色法的方法，采用报道合成青枯菌的16SRrna的引物。
       对青枯菌RS03进行PCR扩增，PCR反应体系为20
       μL，其扩增程序为94℃，3min，94℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，72℃，10min，35个循环。


       将辣椒茎秆从距离地上部位处一节手指的部位用锯子将其切断，观察健康和感病辣椒茎秆的横切面，将辣椒的根从土壤中挖出。
       在流动的水下冲洗干净，放在报纸上备用，观察健康和感病辣椒的
       根部变化
       ，
       将提前灭好菌的3种双糖和3种糖醇分别加入到基础培养基。


       使其终浓度为1%，将
       RS03
       涂板置于28℃培养，根据培养基中颜色变化，分析菌株对6种化合物的利用能力，确定菌株的生化型。
       采用报道
       合成青枯菌
       演化型鉴定的PCR引物，采用复合PCR法对供试菌株RS03进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL。
       扩增程序为94℃，3min，94℃，30s，55℃，50s，72℃，90s，72℃，10min，30个循环，PCR产物利用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

汤申宰4314酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事? -
巩谦菡18431183642 ______ 建议你做如下改进: 1. 原始质粒上样2ul,电泳检测,确定质粒质量没问题; 2. 所有酶切体系均改为10ul,其中质粒2ul,酶0.1ul (双酶切时另一种酶也加0.1ul ),buffer终浓度为 1*,剩下为去离子水.酶切时间为4小时左右. 3.电泳用的凝胶最好为新鲜配制的,浓度视质粒大小而定,一般为1%; 电泳的缓冲液最好也是新鲜配制的,电泳电压适当. 1KB的条带拖尾严重,可能是凝胶不新鲜,或者是电泳时电压过高,或者是酶切时间过长.上述建议中已经给出解决方法. 至于你说的奇怪现象,可能质粒已经降解,也可能是酶切过久导致降解,也可能是枪头或者离心管等器材污染,总之保证一切是新鲜的,再做一次.

汤申宰4314做重组质粒双酶切验证,酶切后跑电泳结果条带很模糊是什么原因? -
巩谦菡18431183642 ______ 可能酶过量或者加的质粒体积大带进去杂质产生星号活性.

汤申宰43141%琼脂糖电泳后,为什么看不到我的目的条带? -
巩谦菡18431183642 ______ α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白 原因太多了. 可能是双酶切没有切下来; 可能是电泳时间过长已经跑出去了或者根本就回收错了或者回收操作出问题了(胶回收试剂盒里面的试剂可能过期或者失效了); 可能是T4连接酶有问题; 可能是转化过...

汤申宰4314pcr电泳带看不清楚 -
巩谦菡18431183642 ______ marker没有问题,肯定是你们的产物有问题.你没有上传你的电泳图,我只能试着帮你分析一下.如果说是完全看不到除引物之外的任何条带,这就是说你的PCR反应完全失败,原因就很多了,在引物和模板链没有问题的情况下,你可以试着降低退火温度,延长扩增时间,也就是降低PCR反应特异性,看看会不会得到什么阳性结果.如果你的电泳结果是一片模糊的条带,说明PCR过程中非特异性合成非常多,致使出现非常多的大小不一的片段.这时,你应该试着提高退火温度,缩短扩增时间,减少扩增循环次数,即增加PCR反应的特异性,再看看结果是否有所好转.

汤申宰4314我做的RT - PCR,提取的是动物细胞,DNA电泳有痕迹却没有条带,可能的原因有哪些啊? -
巩谦菡18431183642 ______ 建议建立内参,其次很可能是模板量过低,增加模板量试试吧. 你的痕迹是指你跑出来的条带淡,还是根本就没有跑出来,那些条与你的mark对到上吗.如果对不上可能就是不是你的条带.

汤申宰4314PCR产物电泳时,为什么有的条带不亮,有的特别亮呀? -
巩谦菡18431183642 ______ 如果点样没有误差的话,那应该是PCR仪的问题了,半导体PCR仪用的时候长了,中间和四周温度有误差,温度控制不准,这个产物自然就不同了.可以让厂家给测试一下.或者换一下散热模块之类的.特别是国产的PCR仪,寿命就那么长.

汤申宰4314PCR产物电泳检测结果点样孔很亮,没有目的条带.是什么原因?marker的条带正常. -
巩谦菡18431183642 ______[答案] 一个可能原因,DNA结合了蛋白质,所以跑不出去.加loading buffer后加热(90度以上)一下再上样试试. 另外一个原因,你的产物特别大(不一定是目标产物)

汤申宰4314做PCR以后,跑电泳.结果一条带都没有,为什么 -
巩谦菡18431183642 ______ 可能PCR反应进行的不好,没有得到充足的DNA片段 建议改善反应条件,重做一便.

汤申宰4314pcr电泳出现模糊团状条带是什么原因造成的 -
巩谦菡18431183642 ______ 主带显著的情况下,很可能是引物聚合体.如果没有出现显著的你想要的主带,则是非特异扩增产物.第一种情况没事不用理会,第二种情况需要筛查模版中与引物的非特异性互补区...

汤申宰4314PCR产物电泳时,为什么有的条带不亮,有的特别亮呀?两个样,同样的PCR条件,一块电泳的 -
巩谦菡18431183642 ______[答案] 样里边目的基因的浓度不同