瞬时转染sirna

​一、概念及应用

随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，细胞转染已经成为研究真核细胞基因功能的常规工具。常用于研究基因功能、基因表达调控、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用非常广泛。

细胞转染是指将外源遗传物质（DNA或RNA）导入真核细胞的技术。细胞转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染。

瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但持续时间只有几天（数天内大部分外源性 DNA 会在核酸酶作用下降解或被细胞分裂稀释，一周后便无法再检出）。使用超螺旋质粒 DNA 进行瞬时转染的效率最高，因为其能被细胞更高效地摄取。

稳定转染：外源性DNA可以整合至细胞基因组中，或者作为游离型质粒存在，并可传递至转染细胞的子代。但通常只有单个或几个拷贝的外源性DNA整合至稳定转染基因组中，因此稳定转染基因的表达水平一般低于瞬时转染基因的表达水平。由于外源性DNA稳定整合至基因组的概率很低，因此通常在用于转染的DNA构建体中纳入可筛选标记物（如对各种筛选药物产生抗性的基因，或是可对待转染细胞系有缺陷的必需基因进行补偿的基因），然后在短暂的恢复期后对细胞施加适当的筛选压力。

二、转染方式

化学方法---利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷，如阳离子脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法等。

生物方法---利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中，如病毒感染。（此方法将在下一节详细介绍）

物理方法---在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA，如电穿孔法。

三、常见的转染方法的原理、特点及步骤

以下简单介绍目前实验室最为常用的两种方法。

脂质体转染法：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞（见下图）。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。

特点：脂质体转染法的优点是能够高效转染许多细胞系，适用于高通量筛选，并能够递送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外，该方法既可应用于稳定表达，也可应用于瞬时表达，与其他化学方法不同的是，其可用于将 DNA 和 RNA 向动物和人体内转移；缺点是转染效率依赖于细胞类型和培养条件，因此，需要对每种细胞类型的转染条件和转染试剂进行优化。

实验步骤：将DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和转染试剂分别在不同的管中稀释→将两者混合形成混合物→将形成的混合物加入细胞中，脂质体的正电荷有助于帮助复合物粘附到细胞膜上→复合物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。

电穿孔法：利用电脉冲可逆地击穿细胞膜形成瞬时的膜上小孔，同时细胞膜上电势升高，驱使带电荷的分子（如 DNA）以类似于电泳的方式经临时微孔穿过细胞膜进入胞内（见下图）。当遇到某些脂质体转染效率很低或几乎无法转入时建议用电穿孔法转染。一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。为确保转染成功，针对实验条件优化电转参数是极为重要的。电场强度、脉冲形状、脉冲施加次数、缓冲液组分等因素都会影响转染效率。

特点：与其他转染方法相比，电转染具有诸多优势，其中主要优势包括：适用于所有细胞类型的瞬时和稳定转染；在确定最佳电转染条件的情况下，能够在短时间内转染大量细胞。电转的主要缺点在于高电压脉冲可引起大量细胞死亡，仅部分细胞膜可以成功修复，因此相比化学转染方法，电转染需要使用更多数量的细胞。

实验步骤：利用电转缓冲液重悬细胞→对含有核酸，缓冲液，细胞的混合物给予合适的电脉冲→电脉冲在细胞膜上形成电势差，诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞→将细胞返回到生长培养基中，使其慢慢恢复→检测基因表达或沉默情况。

四、影响转染效率的因素及注意事项

转染效率受到多种因素影响，主要因素有以下几种：

转染试剂：不同细胞系转染效率通常不同，因此在转染实验前需要根据细胞特性选择合适的转染试剂。可以通过已发表文献和转染试剂提供的已成功转染的细胞株来进行选择。

细胞状态：转染前细胞活力和总体健康状况是转染产生变异性的重要来源。一般建议在转染前至少24小时进行传代培养，以确保细胞在传代后处于转染的最佳生理条件，细胞活力大于 90%。最适合转染的细胞是复苏经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。为确保转染的重复性，一般选择低细胞代次（<30，能确保基因型不变）。如果发现同一株细胞转染效率降低，可以尝试重新复苏细胞以恢复最佳结果。此外，污染会严重影响转染结果。

汇合度：转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此要根据具体的细胞类型、应用和转染技术，来优化确定相应的最佳密度。如使用阳离子脂质体转染时，贴壁细胞一般达到 70%-90% 的汇合度，悬浮细胞达到 5 × 105 至 2 × 106 个细胞/mL 的密度，即可获得良好的结果。但不同的转染试剂，针对不同细胞系要求转染时的最适细胞密度各不相同，因此使用新的细胞系或者新的转染试剂时，应进行实验优化并建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。不同实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。

培养基

不同的细胞或细胞类型都有非常特定的培养基、血清、补充剂要求，选择最适合细胞类型的培养基和转染方法在转染实验中起着非常重要的作用。一些细胞系和原代细胞可能需要特殊的包被材料（如多聚赖氨酸、胶原蛋白、纤连蛋白等）以附着于培养板并获得最佳的转染结果。

可参考已发表文献或细胞来源处获得获得针对特定细胞类型的合适培养基和转染方法，如果没有相关信息，则需要根据经验或筛选实验确定。

血清

一般培养基中存在血清可增强 DNA 转染。但使用阳离子脂质体转染时，一些血清蛋白会干扰复合物的形成，因此应在无血清条件下制备DNA-脂质体复合物。当使用 RNA 转染细胞时，建议在无血清条件下转染，以避免潜在的RNase污染。

抗生素

一般用于瞬时转染的培养基中可含抗生素。不过，由于阳离子脂质体试剂可增加细胞通透性，因此也可能增加递送到细胞内的抗生素量，从而导致细胞毒性以及较低的转染效率。因此不建议在转染培养基中加入抗生素。可在转染前铺板细胞时，使用无抗生素的培养基。

对于稳定转染，不应在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是 Gibco Geneticin 选择性抗生素的竞争性抑制剂。在构建稳定的细胞系时，在转染程序后预留 48-72 小时供细胞表达抗性基因，之后再加入选择性抗生素。

转染分子类型：

质粒 DNA 是最常用的转染载体。质粒 DNA 的拓扑结构（线性或超螺旋）和大小会影响转染的效率，超螺旋质粒 DNA 瞬时转染的效率最高。在稳定转染中，相对于超螺旋 DNA，虽然使用线性 DNA 会导致细胞的 DNA 摄取量较低，但 DNA 整合到宿主基因组中的效果更优。虽然寡核苷酸、RNA、siRNA 和蛋白质等其他大分子也可以转染到细胞中，但在使用这些大分子时，需要优化转染条件。

五、总结

没有一种方法适用于所有类型的细胞和实验应用，不同的方法在转染效率、细胞毒性、对正常生理的影响、基因表达水平等方面均存在广泛的差异。因此应根据具体的细胞类型和实验需求来选择转染方法，理想的方法应具有高转染效率、低细胞毒性、对正常生理的影响尽可能小、易于使用和高重复性。同时，应根据该方法进行各种转染条件的优化，以建立一个稳定的实验方案。

来源：“中科生命学堂”GZH，作者~叶师兄；
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