质粒dna电泳结果

［实验原理］

在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细

胞具有的能够接受外源 DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导 产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的 CaCl2 溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜 的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃ 可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

［实验仪器、材料和试剂］

一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低 温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴， 微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15 分钟。

二、材料：土壤农杆菌 LBA4404 菌株或其它农杆菌菌株

三、试剂：YEB 液体培养基（1L）：酵母提取物 1g，牛肉膏 5g，蛋白胨 5g，蔗糖  5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。 利福平（Rif）储液：50mg/ml 20mM CaCl2，高压灭菌。

［实验步骤］

1、挑取根癌农杆菌 LBA4404 单菌落于 3ml 的 YEB 液体培养基（含 Rif 50mg/l） 中，28℃振荡培养过夜；

2、取过夜培养菌液 1ml 接种于 50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至 OD600 为 0.5；

3、取 2ml 菌液，13000rpm，离心 30sec, 弃上清；

4、加入 1000µl 20mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴 30min；

5、13000rpm，离心 30sec，弃上清，置于冰上，加入 500µl 预冷的 20mM CaCl2， 充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr 内使用，或液氮中速冻 1min，置-70℃保存备用。

质粒 DNA 直接导入农杆菌

［实验原理］

在低温下，外源 DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收 DNA。（加 入热激原理）转化了质粒 DNA 的农杆菌随后 28℃恢复培养，可使质粒上携带的编码抗生 素的抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生 长，而没有转化的细胞则无法生长。

［实验仪器、材料和试剂］

一、仪器：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅，-70℃ 超低温冰箱，培养皿，微量进样器及吸头。

材料：根癌农杆菌 LBA4404（或 EHA105）感受态细胞，质粒 pCAMBAI1300+SPR 植物 表达载体

二、试剂：液氮

YEB 液体培养基（1L）：酵母提取物 1g，牛肉膏 5g，蛋白胨 5g，蔗糖 5g，MgSO4•7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

YEB 固体培养基：每升 YEB 液体培养基加 15g 琼脂粉，高压灭菌。

卡那霉素（Kan）储液：50mg/ml

利福平（Rif）储液：50mg/ml

YEB 固体培养基平板（Kan 抗性）：灭菌后的 YEB 固体培养基待其温度降至 50℃时加 入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度分别为 100µg/ml 和 50µg/ml，混匀后立 即倒入培养皿，凝固后 4℃倒置保存。

［实验步骤］

1、在 200µl 感受态细胞中加入 2－6µl 质粒（pBI121）DNA，冰浴 5min，液氮中速 冻 5min；

2、迅速转入 37℃水浴中，热激 5min；

3、加入 1ml YEB 液体培养基，28℃慢速振荡培养 2－4 小时；

4、3000rpm 离心 4min，去一部分上清，留取 200µl 菌液涂布于含有 50µg/ml Kan 和 50µg/ml Rif 的 YEB 平板；

5、放置约 0.5h，待水份干后，28℃培养约 24 小时至长出菌落。

农杆菌转化子的鉴定

［实验原理］

经改造的 Ti 质粒（只含有帮助 T-DNA 跳到植物染色体上的 Vir 区）存在于农杆菌工程 菌株中，含有 T-DNA 的双元载体（Binory Vectors）完成重组后可以在大肠杆菌中扩增， 再转入农杆菌中。从抗性培养基上筛选得到的农杆菌转化子中应携带转入的重组质粒，而对 照菌株则没有。

碱裂解法是一种应用最为广泛的质粒 DNA 提取方法，该法用于从小量培养物中抽提质 粒 DNA，比较方便、省时，提取的 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、PCR 甚至测序。 提取质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而使其分离。当细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，在 pH 高达 12.6 的碱性条件下，蛋白质和染色体 DNA发生变性，染色体 DNA 的氢键断裂、双螺旋结构解开，而质粒 DNA 虽大部分氢键也断裂， 但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当加入中和液醋酸钾或醋酸钠高盐 缓冲液时，质粒 DNA 恢复原来的构型，而染色体 DNA 不能复性，形成缠绕的网状结构， 通过离心，染色体 DNA、蛋白质-SDS 复合物随细胞碎片等沉淀下来，质粒 DNA 则留在上 清中。

［实验仪器、材料和试剂］

一、仪器：台式高速离心机，高压灭菌锅，恒温摇床，恒温水浴，电泳仪及电泳槽，紫 外灯，加样器（pipettor），小离心管（eppendorf tube），吸头（tip），三角瓶， 牙签。

二、材料：含质粒的农杆菌 LBA4404（或 EHA105），农杆菌 LBA4404 或 EHA105）

三、试剂：YEB 液体培养基（1L）：酵母提取物 1g，牛肉膏 5g，蛋白胨 5g，蔗糖  5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）

10mmol/L EDTA（pH8.0），高压灭菌（6.895×104Pa），4℃保存

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH  ，1％ SDS

先分别配成浓度 0.4M NaOH（灭菌）及 2％ SDS，用前等体积混合。

溶液Ⅲ：3mol/L NaAc/KAc（pH4.8）10

5mol/L NaAc/KAc 60ml（灭菌） HAc 11.5ml

H2O 28.5ml（灭菌），三者混合

EB：贮液浓度为 10mg/mL，工作浓度为 0.5µg/ml

TAE：40mmol/L Tris-HAc，2mmol/L EDTA，pH8.0，Tris 饱和酚、氯仿、无 水乙醇、RNase A

［实验步骤］

1、质粒 DNA 的提取

（1）挑取一个单菌落接种于 3ml 含相应抗生素的 YEB（50mg/L Km）液体培养基中， 28℃剧烈振荡过夜；

（2）收集 1.5ml 过夜培养物于 1.5ml 离心管中，10000rpm 离心 30sec 收集菌体，尽 可能除尽培养基；

（3）向细胞沉淀中加入 100µl 预冷的溶液Ⅰ，剧烈振荡，使菌体充分悬浮；

（4）加入 200μl 溶液Ⅱ，立即温和颠倒离心管 4-10 次，避免剧烈振荡；

（5）加入 150μl 溶液Ⅲ，温和颠倒离心管 4-10 次，将离心管置冰浴 5min；

（6）于室温 12000g 离心 15min，将上清液转入新的离心管中（尽量避免吸取沉淀）；

（7）加入 0.6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀；

（8）12000g 离心 10min，弃上清液，加入 400μl 70%乙醇，12000g 离心 8min， 弃上清，在真空抽干或在超净工作台中吹干；

（9）加入 10µl 含 20µg/ml RNase A 的 TE 或重蒸水溶解 DNA，37°C 温育 30min；

（10）-20℃保存。

2、用琼脂糖电泳检测质粒 DNA（或用 PCR 进行检测）

用 1×TAE 配制 0.8％的琼脂糖凝胶，取所提取的质粒 DNA 溶液 2-5µl 进行电泳，

50-100v 约 0.5-1hr，紫外灯下观察结果。

烟草遗传转化

[实验器材]

实验摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、 三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。

[实验药品]

MS 培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、 无菌水、6-BA、NAA、0.1%升汞、70%乙醇。

烟草愈伤诱导或分化培养基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)

烟草生根培养基：MS+ NAA(0.1mg/L)

烟草选择培养基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)+75mg/L Km+500mg/L

羧卞青霉素（Cb）

[实验步骤] 1.受体材料的准备与预培养

（1）取自田间栽培烟草植株，用蒸馏水冲洗 1 遍后，以 70%乙醇清洗 45s，再以 0.1%的升汞消毒 6-8min，无菌水冲洗 5 遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）用灭过菌的打孔器将无菌烟草叶片凿成 6mm 的叶盘（或用手术刀切成 5－10mm方形叶片。

（3）将叶盘或叶片接种在烟草愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，预培养 2－3天，材料切口处刚刚开始彭大时备用。

2.根癌农杆菌培养

（1）从平板上挑取单菌落，接种到 20mL 附加相应抗生素（卡那霉素）的 YEB 液体培养 基中，在恒温摇床上，于 28℃下以 180r/min 培养至 OD600 为 0.6~0.8（约需 17h）。

（2）OD600 为 0.6~0.8 的菌液，按 1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素的 YEB 液体 培养基中，可同时加入 100~500µmol/L 的乙酰丁香酮。在上述相同的条件下再培养 6h 左 右，待 OD600 为 0.2~0.5 时即可用于转化。

3.浸染

在超净工作台上，将菌液倒入无菌三角瓶中，从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（5~30min）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

4.共培养

将浸染过的外植体接种在烟草愈伤组织诱导或分化培养基上，在 28℃暗培养条件下共 培养 2~4 天。

5.选择培养

将经过共培养的外植体移到加有选择压的烟草愈伤组织诱导或分化培养基（附加 500mg/L 的羧苄青霉素，抑制根癌农标菌生长）上，在光照为 2000~10000lx、25℃条件 下进行选择培养。

6.继代选择培养

选择培养 2－3 周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将 这些抗性材料转入相相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分 化培养基中使其生长或诱导生化。

7.生根培养

待不定芽长到 1cm 以上时，切下并插入含有选择压的烟草生根培养基上进行生根培养， 两周左右长出不定根。

附 YEP 可用 LB 培养基替代，配方如下：

LB 固体培养基和 LB 液体培养基 酵母提取物(yeast Ext)\t5g/L

蛋白冻(peptone)\t10g/L NaCl\t10g/L

液体 LB 培养基不含琼脂，供摇床培养农杆菌，含 0.5%琼脂的固体供短期保存菌种用。(pH7.0-7.2)

尚仇菁1415大肠杆菌染色质DNA,质粒DNA,RNA电泳时哪个跑得快 -
闻佩侦13928256395 ______ 大肠杆菌染色质DNA,质粒DNA,RNA电泳时哪个跑得快 你是做什么电泳,如果是普通电泳,RNA污染量不大的话可能看不到,如果比较大的话会成弥散的条带,因为在电泳过程中会降解,如果提取的RNA质量较好,电泳过程没有降解掉的话,可能会有一条比较清晰的条带在目的条带的下方,因为RNA电泳比DNA跑的快 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子.现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子.在基因工程中质粒常被用做基因的载体.许多细菌除了染色体外,还有大量很小的环状DNA分子,这就是质粒(plasmid)

尚仇菁1415碱裂解法提取质粒后 电泳拖尾严重,是什么原因 -
闻佩侦13928256395 ______ 现在实验室大多用的是提取试剂盒,如果自制溶液碱性过强会有可能出现拖尾现象,蛋白沉降步骤不完全也会有可能导致基因组DNA降解出现拖尾现象.类似于溶液方面的问题一般比较容易排除,而且比较容易改正. 电泳结果拖尾大部分原因与实验操作有关,在加入碱性溶液裂解细胞后操作需要轻柔,静置时间不宜过长,剧烈震荡以及静置时间过长均可导致质粒DNA断裂,电泳结果中出现拖尾现象. 有什么问题可以继续追问,欢迎交流.

尚仇菁1415你提取的质粒DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中表现出几条带?并解释这种现象? -
闻佩侦13928256395 ______[答案] 三条 最慢的一条是超螺旋,中间的是开环的,最下面一条是直链

尚仇菁1415请问这个DNA电泳结果是什么情况?怎么分析?第一个是Marker -
闻佩侦13928256395 ______ 跑的什么样品啊?是酶切的还是质粒还是PCR啊? 有一条条带比marker最大的一条带都大,是没有切动的质粒,还是做PCR加了太多模板啊? 最下面的部分如果是质粒样品,应该就是RNA没有消化,如果是PCR,就是有引物二聚体,总之电泳的这个样品不是很好. 如果提的是细菌基因组的话,还说的过去,因为本身在抽提过程中有几个组分,一个是基因组DNA,会很大,大约会在Marker指示的20K附近.中间的条带很有可能是细菌中带有的质粒.但是确实从整个泳道的信息来看,泳道中没有条带的地方也有一点信号不知道是什么原因.另外,RNA确实没弄干净,要加RNase.

尚仇菁1415原始菌株和突变菌株做对比,提取质粒后跑电泳,原始的只有一条带最亮,而突变体却出现了2条甚至更多.. -
闻佩侦13928256395 ______ 难道你忘了质粒DNA的几种形态么.质粒电泳条带一般是3条左右,其中一道两条亮.

尚仇菁1415质粒双酶切后怎么会这个样子 -
闻佩侦13928256395 ______ 线性化的跑得最慢. 质粒酶切后,和没有酶切的对照相比.应该会多出一条带,这条带应该是跑得最慢的,也就是显得比原来的更大.酶切的不彻底的话,原来的那几条带也可能存在wjswj(站内联系ta)酶切之前你看到的应该是超螺旋,所以显的比较小:)zbq-92(站内联系ta)超螺旋的跑的最快,其次是线性的dna,最后跑的最慢的是带缺口(即开环)的.用碱裂解法提取质粒看不到线性的带,只有其余的两条,但不一定是那一条亮. 如果你的超螺旋那条特别亮,酶切后同样大小的dna片段,由于超螺旋变为线性,电泳就会显示比超螺旋的带大.

尚仇菁1415大肠转化后提的质粒,跑电泳出现3条带,求高人解释每条带分别是什么?(第一列是空质粒) -
闻佩侦13928256395 ______[答案] 质粒DNA分子具有三种构型:共价闭合环DNA(cccDNA,SC构型)、开环DNA(OC构型)和线性分子(L构型).在细菌体内,质粒DNA是以负超螺旋构型存在的.在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的的同一种质粒DNA,尽管分子量相同,但具有不同的电泳迁移...

尚仇菁1415为什么抽提的质粒大于目的片段和载体的和 -
闻佩侦13928256395 ______[答案] 不知道具体的情况是什么,只能有几种猜测: 1.有些DNA MAKER的质量不是很好,略微的偏差是正常的. 2.电泳时质粒的状态对最后的结果有很大的影响,双螺旋闭环的质粒电泳时跑得快,比实际偏小,而提取质粒时裂解过了的质粒会开环,此时...

尚仇菁1415单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,... -
闻佩侦13928256395 ______[答案] 首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近. 建议:首先电...