转染shrna质粒方法
衡胞律2071小白求助:shRNA质粒稳转细胞一般能转几个进去 -
潘阙苏19152518076 ______ 两种质粒是可以同时进入同一个感受态细胞的,比如构建腺病毒载体时.但是要求两种质粒进入同一个感受态细胞,转化效率非常低,一般需要电转或者其他的特殊处理. 由于质粒的不兼容性,拥有同种复制子的质粒不能在同一细胞内稳定共存,经过几代的复制,会质粒丢失,所以并不是任何两个或两个以上质粒都可以在同一细胞内稳定存在,但是可以同时进入. 稳定转染的细胞株,就是转染后质粒可以稳定整合到基因组上不会因细胞分裂而丢失.区别于质粒瞬时转染不能长时间保留质粒在细胞里.
衡胞律2071质粒如何提取
潘阙苏19152518076 ______ 需要掌握技能 1. 质粒转化 具体操作步骤: 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管; 将感受态细菌(competent cells)从-70℃冰柜中取出,快速吸取50ul感受态细菌,加入含质粒DNA的1.5ml的离心管; 轻轻地旋转以混匀内容物,在冰中放...
衡胞律2071shRNA质粒载体的构建? -
潘阙苏19152518076 ______ 根据 已发表的BRAF基因序列,设计合成3条BRAF特异性的shRNA编码序列(其中一条shRNA特异性针对黑素瘤中最常见的BRAF V599E错义突变设计)和一条与人基因组无同源性的阴性对照shRNA编码序列.将退火后的双链shRNA编码序列重组于pGenesil-1质粒中,进行双酶切和测序鉴定.结果双酶切显示shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1质粒中,测序结果证实插入片断与设计序列完全一致.结论所设计的shRNA编码序列被正确插入质粒骨架,成功构建了BRAF基因序列特异性的shRNA质粒载体. 参考网址on http://www.bio1000.com/enterprise/247819.html
衡胞律2071转染时质粒怎么定量 -
潘阙苏19152518076 ______[答案] 质粒是先用分光光度计定浓度的,然后根据你转染的方法,转染细胞的多少确定要转多少质粒,然后就可以算加入的体积了.
衡胞律2071带有目的基因的质粒怎样导入受体细胞 -
潘阙苏19152518076 ______ 你的受体细胞是什么?不同种类的细胞方法是不同的,转化效率也是不同的.所有转化法都需要先把受体细胞制作成感受态细胞. 最好操作的就是大肠杆菌细胞.可选择的方法有:热激法,电穿孔法,化学转化法等. 酵母:氯化锂转化法,电穿孔法,这两种方法一般需要把环形质粒线性化. 真核细胞:原生质体融合,基因枪法,精子介导法,病毒载体介导法,显微注射法,花粉管介导法等等.
衡胞律2071采用慢病毒载体构建shRNA载体有什么优势? -
潘阙苏19152518076 ______ 1.慢病毒可以转染难转染的细胞,可转染的细胞种类多2.慢病毒载体所携带的目的基因可以整合入细胞基因组,稳定长期表达.这样,shRNA可以长时间的KNOCK DOWN目的基因3.目前所用的慢病毒安全性很高,满病毒包装系统的安全性也很高4.此技术已经较为成熟
衡胞律2071请问什么是基因转染技术 -
潘阙苏19152518076 ______ 常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法,基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA 送入细胞内,并在细胞内表达.转染方法有多种,根据不同的细胞,贴壁或悬浮细所可选用不同的方法,其目的是要达...
衡胞律2071各位高人 我想问一个问题,我将一个目的基因连接到质粒上 我想将这个质粒连同目的基因,一块扩增很多个 -
潘阙苏19152518076 ______ 提取质粒.这个量就很大了.给你个简单的protocol PCR 你的基因 对PCR产物,和空质粒,因为突变很多,一定要测序到完全正确的序列.如果没有测到.如果菌落挑完了,突变又多),不如电激转化好,就重新转化.这段时间要多扶老太太...
衡胞律2071什么是基因转染 -
潘阙苏19152518076 ______ 基因转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”.其中,核酸包括DNA(质粒和线性双链DNA),反义寡核苷酸及RNAi(RNA interference).基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究(基因表...
衡胞律2071流式细胞仪分析shrna效率结果怎么看 -
潘阙苏19152518076 ______ shRNA的效果一般是测目标基因的表达量. 1. 先用iso-type control,也就是非特异性的同型抗体染的细胞测,设好了阴性的阈值. 2. 再用特异性抗体测用对照序列shRNA转染的细胞,看阳性细胞的比率 3. 再测用shRNA转染的实验组的细胞,看阳性细胞的比率. 4. 最后对比2和3的阳性细胞的比率有无变化.如果有明显减低,说明shRNA有效.变化的百分率就是shRNA的效率 5. 如果阳性比例没有明显变化,但是细胞的荧光强度有偏移,就比较阳性细胞荧光强度的median,或者mean