酶切后的质粒

柱式质粒提取试剂盒

产品简介：

采用优化的 SDS-碱裂解法裂解细胞，高效去除抑制物等杂质，离心吸附柱内的硅基质膜在

高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，并最大限度的去除蛋白质、基因

组 DNA、RNA 和其他杂质，最后在低盐、高 pH 的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质

膜上洗脱，每个吸附柱可吸附高达 50μg 的质粒 DNA。纯化的质粒 DNA 可直接用于酶切、

PCR、测序、转化、转染一些常规的传代细胞等生物学实验。

产品内容：

储存条件：

RNase A，-30 ~ -15℃保存，干冰运输；

其他组分 15 ~ 25℃保存，室温运输。

使用步骤：

1、取 5-15 mL 过夜培养菌液加入离心管中，12000 rpm 离心 1 min 收集菌体沉淀，尽量吸弃

上清。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 500 μL Buffer P1（已加入 RNase A），使用移液枪或涡

旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀，混匀至无菌块。

3、向离心管中加入 500 μL Buffer P2，温和上下颠倒混匀 4-6 次，充分混匀使菌体裂解，此

时溶液应变得清亮粘稠。

注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA。所用时间不应超过 5 min，以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入 700 μL Buffer P3，立即温和上下颠倒混匀 8-10 次，充分混匀，此时应出现白色絮状沉淀，12000 rpm 离心 10 min。

注意：P3 加入后立即混合，避免产生局部沉淀。如果离心完仍有沉淀漂浮，可延长离心时间取上清。

5、将步骤 4 中的上清液分批转移到已装入收集管的吸附柱中，12000 rpm 离心 1 min，倒掉

收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：一根吸附柱最大容积为 750 uL，请分两次转移上清液到吸附柱中。

6、向吸附柱中加入 500 μL Buffer PD，12000 rpm 离心 1 min，弃废液。

7、向吸附柱中加入 600 μL Buffer PW（使用前请确认是否加入无水乙醇），12000 rpm 离心

1 min，弃废液。

注意：加入漂洗液 PW 后，室温静置 2-5 min，有助于更好的去除杂质。

8、重复一次步骤 7。

9、将吸附柱重新放回收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液。

注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，确保乙醇挥发干净。

10、将吸附柱放到一个干净灭菌 1.5 mL 离心管中，将吸附柱开盖静置数分钟。向吸附膜中

间位置悬空滴加 50-100 µL Buffer TE 或 ddH2O（可提前放在 55 - 65 ℃水浴锅中预热，提高

质粒 DNA 回收率），室温放置 2 min。12,000 rpm ，离心 2 min 收集质粒 DNA 溶液（若需

要获得最高产量，建议将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复第 10 步进行二次洗脱。）。

11、质粒溶液保存在- 20℃。

注意事项：

1、使用前请短暂离心 RNase A，将试剂盒提供的 RNase A 溶液全部加入 Buffer P1 中，置于

4℃保存。

2、首次使用前按 Buffer PW 瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇稀释 Buffer PW，于室温保

存。

3、若低温保存时，Buffer P2、Buffer P3 和 Buffer PD 溶液容易产生白色沉淀，使用前可室

温放置一段时间，必要时可在 37℃水浴锅中预热至沉淀完全溶解，混匀后再使用。

4、Buffer PD 可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为 endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、

JM 系列）等核酸酶含量较高的菌株时，必须使用 Buffer PD。

5、处理低拷贝质粒时，提高菌液的用量，并按比例扩大 Buffer P1、Buffer P2 和 Buffer P3

的用量。

6、使用 Buffer P2、Buffer P3 和 Buffer PD 应戴手套，使用后应立即盖紧盖子。

7、自备试剂：乙醇。

徐蓉耿1250质粒酶切后条带会变大?有多大变化? -
储蕊美18291242556 ______ 质粒不酶切在跑胶时显现出来的条带大小是不等同于酶切后正确的条带大小的.质粒不酶切是环形DNA分子跑胶时不同于一般的线性DNA分子

徐蓉耿1250tev酶酶切后蛋白电泳上会显示tev酶的条带吗 -
储蕊美18291242556 ______ 酶切前,质粒电泳图一般是三条条带,并认为这三条带从上到下一次是线性、开环、超螺旋.其实可能会比这条带更多些,可以认为是中间复合体状态. 酶切后,因为超螺旋状态的质粒被切成线性,所以条带会有一条条带.如果是双酶切,或是质粒上的酶切位点比较多的话,会有两条或更多条带.

徐蓉耿1250质粒pcr结果很好,为什么酶切却做不出来 -
储蕊美18291242556 ______ 质粒pcr结果很好,为什么酶切却做不出来 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了. 你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题. pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常. 换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.

徐蓉耿1250单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,... -
储蕊美18291242556 ______[答案] 首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近. 建议:首先电...

徐蓉耿1250重组质粒可以变成链状的吗?将质粒和目的基因用限制酶切割后能不能只连一边,形成重组的链状的质粒,再将此链状的重组质粒导入受体细胞? -
储蕊美18291242556 ______[答案] 线状质粒一来难以导入受体细胞,二来线状DNA在宿主,尤其是原核宿主内会被很快降解.因此一定要使用环状质粒来转化受体细胞.

徐蓉耿1250提完质粒后需要做什么工作?是跑琼脂糖电泳还是做PCR检测?PCR检测和酶切检测各指的什么? -
储蕊美18291242556 ______[答案] 一般先跑琼脂糖电泳检测是否提出了高质量的质粒,然后通过PCR检测所提的质粒是否是目的质粒. PCR检测指用特异引物对目的DNA进行PCR,根据产物判断 DNA是否含有目标序列.酶切检测则是通过对目的DNA上已知酶切位点的酶切,根据产物...

徐蓉耿1250前些日子做克隆 一直没有结果 最后酶切产物一直是质粒 我把详细过程罗列出来,1 准备工作:灭菌 2连接:取1μL载体(PEASY)和4μL产物于一离心管,离... -
储蕊美18291242556 ______[答案] 不太理解“酶切产物一直是质粒”的意思,是指仍然主要有3条条带吗? 不清楚你的插入片段是不是含有EcoRI 酶切位点,但是pEAZY系列载体不是都含有EcoRI位点的,比如transgen公司的pEASY-Blunt 和pEASY-T1是没有EcoRI的,但是pEASY-T3...

徐蓉耿1250刚活化后 提取的质粒(小量试剂盒提取法) 电泳图为什么会出现2、3条带?这是中间载体的质粒,马上要酶切 之后链接,之前是因为没有链接成功,所以怀... -
储蕊美18291242556 ______[答案] 这是很正常的,质粒提取过程中或多或少会对质粒本身造成一定的损伤,根据损伤的不同,质粒通常会出现三种不同的构型... 如果楼主要看质粒有没有问题,那么必须得酶切后跑电泳,酶切后的质粒一般只会有一条带,并且电泳能够准确反应其分子...

徐蓉耿1250pcr扩增出的片断正确但双酶切结果却偏大,不只是为什么?请高手指点?我的酶切底物是构建好的质粒载体.原来还酶切的正确但自从转菌之后再提取质粒... -
储蕊美18291242556 ______[答案] 可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.