酶切质粒体系
仲肿志2771提质粒的目的是什么?酶切的目的是什么? -
虞冰哗13324492810 ______ 提取质粒作为运载体,运载体必须具备以下条件: 1.能够在宿主细胞内复制并稳定保存; 2.具有多个限制酶的切点,以便与不同的外来基因链接; 3.具有某些标记基因,便于进行筛选. >>常用的运载体有:质粒、噬菌体、灭活的动植物病毒等;而质粒为最常用的运载体. 酶切的目的即为了获得目的基因.
仲肿志2771双酶切酶切体系和buffer怎么设计比较合适? -
虞冰哗13324492810 ______ 体系不管多大,都有相应的buffer,只要将buffer变为1X工作浓度就行了,两个同时切的话,需要注意酶的量,看单位是多少,一般是1ul的酶切1ug的质粒或者其它DNA序列,尽量酶的体积不能超过体系的10%,因为里面含有甘油,可能会影响酶切效率.
仲肿志2771为什么要对重组质粒DNA进行双酶切 -
虞冰哗13324492810 ______ 双酶切就是为了验证是否有目的基因,如果双酶切条带正确,而且PCR也没有问题,就可以确定质粒构建成功. 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点.如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好.在质粒...
仲肿志2771分别比较酶切前后的质粒和基因组DNA;酶切后的质粒和基因组DNA有何不同, 为什么? -
虞冰哗13324492810 ______ 想问问你是用什么方法比较? 本质上来说,质粒是环状的,基因组是超螺旋,而酶切后都是线状片段. 电泳检测来说,质粒根据其螺旋形式不同,可以跑成2-3条带,基因组则是一大团,而酶切后,都会变成明亮的、分界明显的线状片段,跑成梯子一样的结果.
仲肿志2771Xho1和Nde1 50μl双酶切反应体系的配制?用Xho1和Nde1对载体质粒和目的片段分别进行双酶切,50μl的酶切体系应该怎样配制?我不知道每种试剂加多少好... -
虞冰哗13324492810 ______[答案] 由这两种酶组成的双酶切体系并不需要添加BSA,请你仔细核对,两种酶的最适反应温度均为37摄氏度所以双酶切温度应为37摄氏度.如果选用TaKaRa的限制性内切酶那么Buffer应使用H Buffer,对于50 μl的酶切体系而言应分别加...
仲肿志2771酶切中DNA的用量是怎么算的?我是新手请问这个质粒DNA要是换算成用量ul单位怎么换算呢? -
虞冰哗13324492810 ______[答案] 在一定范围内就行,没有严格规定,十几ng到上百ng都切出来过,DNA多就多加点酶.另外,说明书里也有,1U酶切割1ug的质粒,酶的量不要超过酶切体系的1/10.
仲肿志2771单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,... -
虞冰哗13324492810 ______[答案] 首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近. 建议:首先电...
仲肿志2771单酶切和双酶切的定义分别是什么?它们有什么不同? -
虞冰哗13324492810 ______ 单酶切就是只用一个限制性内切酶去切你的质粒,环状的质粒就成为线状的了,但质粒的大小不变双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒就变成两段线状DNA了.回收你需要的那一段,因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端(当然目的基因也要用这两种酶切才行),在T4DNA连接酶在作用下,它们就连到一起了.你该看看《生物化学》或基因工程方面的书.这都是基本的知识啊.
仲肿志2771酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事? -
虞冰哗13324492810 ______ 建议你做如下改进: 1. 原始质粒上样2ul,电泳检测,确定质粒质量没问题; 2. 所有酶切体系均改为10ul,其中质粒2ul,酶0.1ul (双酶切时另一种酶也加0.1ul ),buffer终浓度为 1*,剩下为去离子水.酶切时间为4小时左右. 3.电泳用的凝胶最好为新鲜配制的,浓度视质粒大小而定,一般为1%; 电泳的缓冲液最好也是新鲜配制的,电泳电压适当. 1KB的条带拖尾严重,可能是凝胶不新鲜,或者是电泳时电压过高,或者是酶切时间过长.上述建议中已经给出解决方法. 至于你说的奇怪现象,可能质粒已经降解,也可能是酶切过久导致降解,也可能是枪头或者离心管等器材污染,总之保证一切是新鲜的,再做一次.
仲肿志2771pcr扩增出的片断正确但双酶切结果却偏大,不只是为什么?请高手指点?我的酶切底物是构建好的质粒载体.原来还酶切的正确但自从转菌之后再提取质粒... -
虞冰哗13324492810 ______[答案] 可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.