酶切buffer的选择

祝荆弦2994Xho1和Nde1 50μl双酶切反应体系的配制?? -
邴温冒17528425385 ______ 由这两种酶组成的双酶切体系并不需要添加BSA,请你仔细核对,两种酶的最适反应温度均为37摄氏度所以双酶切温度应为37摄氏度.如果选用TaKaRa的限制性内切酶那么Buffer应使用H Buffer,对于50 μl的酶切体系而言应分别加入1.5 μl的Xho1和Nde1并且加入5 μl的10*H Buffer(使得酶切体系中的Buffer浓度为1*工作浓度),最后加入适量的质粒分子并双蒸水补足反应体积至50 μl.

祝荆弦2994再次请教生物问题 -
邴温冒17528425385 ______ 一般,防止酶切产物自连最常用的就是双酶切,因为产生的粘性末端不同,所以很难发生自连.但实际上最后筛选的时候经常也会出现空载体的情况,这个很大一部分原因是有部分载体没有切动,并不是载体自连的问题.这些没有切动的载体转化率是非常高的,这是转化过程中假阳性的最大来源.载体自连最容易发生的情况有两种,一种是单酶切,一种是平末端连接.这两种情况下,通常为了防止载体自连会对酶切后的载体使用碱性磷酸酶处理,将DNA 5'端的-P基团置换成-OH,这样会一定程度的防止载体自连.

祝荆弦2994双酶切的20μL反应体系和反应时间如何确定?最好是说明原理.所用的酶都是Takara公司的 -
邴温冒17528425385 ______[答案] 模板DNA 几百ng-几ug,区别不大 酶1 0.5ul 酶2 0.5ul buffer 去Takara产品目录查双酶切buffer表,按照那个倍数加,有时候需要BSA 水补足 20ul 30或37度,1-5小时都可以.有个别酶需要55度. 注意,酶别加多了,甘油浓度过高影响酶的活性.反应体系...

祝荆弦299420ul双酶切体系和10ul双酶切体系的区别 -
邴温冒17528425385 ______ 20ul双酶切体系和10ul双酶切体系的区别:DNA的量是3.5微升 1、产物浓度不同 20ul双酶切体系比10ul双酶切体系产物的浓度高. 2、DNA反应量不同 20ul双酶切体系所含DNA要比10ul双酶切体系含有的DNA多,进行双酶切时所要切的DNA量也...

祝荆弦2994Takara的NheI 和BamHI双酶切体系表中没有双酶切缓冲体系应该如何选用缓冲液呢?只能进行分步酶切吗? -
邴温冒17528425385 ______[答案] 1、如果你用的是Takara的酶,应该就只能分步了,而且BamHI还是30度反应,虽然也可以在37度切,但如果是分步切的话还是用30度吧. 2、为什么不用NEB的酶呢?可以用buffer1或2同时切(好像是,你需要自己再确认下),而且NEB的这两种酶...

祝荆弦2994若DNA需要使用两种酶进行酶切,应如何进行? -
邴温冒17528425385 ______[答案] 如果能够找到让两种酶同时作用的最佳缓冲液NEBuffer,那就可以同时双酶切.如果找不到就只能采用分步酶切.分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始,酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求,然后加入第二种酶完成双酶切反应....

祝荆弦2994双酶切时,是直接用pcr产物就可以,还是需要 -
邴温冒17528425385 ______ 1、回收PCR产物: 在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用...

祝荆弦2994sall和Ecorl能双酶切吗?酶切体系和条件如何sall和Ecorl能双酶切吗?酶切反应体系和条件如何,想做连接来 -
邴温冒17528425385 ______[答案] 可以,用Takara得酶,缓冲buffer用 一成得buffer H, 其他反映条件同普通反应.我常用50uL反映体系,5ulbuffer 两种酶各1ul,其他得DNA和水补充

祝荆弦2994双酶切切不开,单酶切正确 -
邴温冒17528425385 ______ 被切散了是什么意思?跑胶有明显条带么还是有拖尾现象? 你在双酶切的时候是同时双酶切的还是先切一个再回收切下一个的?如果直接双酶切要注意温度和时间控制,buffer要选择好,如果效果不好的话可以试一试先切一个再回收切下一个.