qpcr扩增的溶解曲线
江选迫4923实时定量PCR的曲线图怎么看?包括标准扩增曲线,目的基因熔解曲线,目的基因的扩增曲线,都怎么看?三个曲线各有什么意义? -
华桦黎19414088506 ______[答案] 先看目的基因熔解曲线,如果只有一个尖锐的锋,而且不是很低温度下出来的(那时Dimer),说明这对引物可以用,这时看Ct值才有意义.标准扩增曲线看Ct值得间隔是否均匀,一般10倍稀释间隔3.3个ct值,同时要保证你的目的基因...
江选迫4923荧光定量pcr溶解曲线为什么会有一个急剧的上升连着急剧下降,形成一个峰. -
华桦黎19414088506 ______ 随着温度升高,当温度达到Tm值时候,DNA就会变性分成单链的,此时荧光染料不能结合NDA所以检测的荧光型号越来越弱. 你说的出现的峰是荧光性号对温度求导后得到的曲线图,出现峰是因为在接近Tm值的位置荧光性号下降的斜率很快导致在对温度求导后出现峰. 出现单峰说明没有非特异性的结合和引物二聚体的产生.
江选迫4923SYBR green PCR溶解曲线有何意义 -
华桦黎19414088506 ______ 作用类似于电泳,但是相对于电泳更灵敏,更清晰一些. 通过溶解曲线可以了解目的产物TM值,是否出现杂峰.一般溶解曲线的结果+电泳的结果和在一起相对比较准确.当然最后片段也可以测序最终确定目的产物. 主要的是:根据溶解曲线...
江选迫4923如何验证目的基因和内参基因的扩增效率一致 -
华桦黎19414088506 ______ 如何验证目的基因和内参基因的扩增效率一致 内参基因和待测基因本来就不一样.扩增曲线和溶解曲线不是一个概念.扩增曲线是每扩增一个循环,测量一次荧光强度.这个由底物的浓度和扩增效率所决定.目的基因和内参的浓度肯定不同,而且引物的序列不同,扩增效率也可能不一样,所以两者的曲线肯定有可能不一样.SyberGreen PCR,溶解曲线是PCR完成以后,对产物逐步加温,测量荧光强度的变化,而不是荧光强度本身.DNA双链在温度达到TM附近时,发生大量的解离,荧光强度的变化最大,出现峰值.这个峰值的位置是由PCR产物的TM值所决定的,和PCR产物的序列,GC比例有关.所以内参基因和目的基因的峰值肯定是不一样的.
江选迫4923谁能具体解释一下荧光定量PCR中溶解曲线的意思以及作用?
华桦黎19414088506 ______ 定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而BIOG PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量.因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等.
江选迫4923RT - PCR融解曲线详解 -
华桦黎19414088506 ______[答案] 融解曲线是荧光定量PCR仪出现后为了考察染料法结果的特异性产生的.大家使用荧光定量PCR的目的(也是荧光定量PCR的宣称优点)有快速、准确及无污染,其中快速的前提之一是不用跑电泳就可以通过扩增曲线考察初始拷贝数的量;准确是因...
江选迫4923大家帮忙看看DNA扩增后电泳为什么是这样子 -
华桦黎19414088506 ______ 大家帮忙看看DNA扩增后电泳为什么是这样子 缩短暴光时间本来就使带变暗,如果再进一步缩短暴光时间,可能其他的带也不清楚了.还是考虑电泳体系的问题:1.首先考虑是你的电压可能有点高,降低电压后适当延长时间可以改善.2.胶灌的...
江选迫4923qPCR那些奇奇怪怪的曲线都代表啥 -
华桦黎19414088506 ______ 奇怪的曲线就代表基因扩增的有问题,可以检测基因的表达量、模板质量、引物有没有降解等等,其次试剂本身的灵敏度也有关系.我用的是ChamQ SYBR qPCR Master Mix,灵敏度就很高,一年前我们实验室就开始用了.
江选迫4923荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办 -
华桦黎19414088506 ______ 1、调整下体系,不要自己配置反应液,最好用商品的MIX,这样各个组分都是最佳的配比. 2、三步法改为两步法,退火延伸设置为一步,大部分的温度为60度,这个只是建议,具体看你买的试剂的说明书,会有具体的说明. 3、很有可能有非特异性扩增,自己排查下反应体系,根据溶解曲线是否单峰,扩增曲线CT值综合分析.
江选迫4923你好,我想请问你关于real - time PCR 中溶解曲线的横轴和纵轴的意义? -
华桦黎19414088506 ______ 横坐标是温度,每个温度点一个.一般从60到98度 纵坐标是荧光强度的变化值(不是强度本身).一开始加热的时候,虽然荧光强度比较强,但是由于双链没有解离,所以荧光强度保持不变.当加热接近于PCR产物Tm时,双链开始解离,荧光强度变小,机器会比较前后2个温度点的荧光强度,然后把2者的差值标在图上.Tm到达时,有一般双链解离,这时的荧光强度变化最大(峰值).再加热,双链全部解离,所以荧光强度的变化又变小了. 你PCR产物大小不一,但是只要有相同或者相近的Tm,峰值就有可能在一个位置上.如果实际测得的峰值和理论计算的吻合,问题不大.如果有差别,说明有非特异性产物,建议不要再用SYBR GREEN方法.