酶切实验中buffer的作用

DNA 凝胶回收试剂盒

产品简介：

DNA 凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)，是一种用于从 DNA琼脂糖凝胶中回收目的 DNA 的试剂盒。本试剂盒采用优化的缓冲体系和可高效、专一性吸附 DNA 的硅胶柱，从 TAE 或 TBE 琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段，通过离心力或者负压让含有核酸的溶液通过硅胶膜，使核酸在特定溶液环境中吸附在硅胶膜上，经过洗涤、洗脱等步骤得到纯的核酸。纯化的 DNA 可直接用于连接、转化、酶切、PCR、 测序、文库筛选等分子生物学研究。

产品内容：

储存条件：

使用前请先在漂洗液 Buffer PW 中加入 12 mL 无水乙醇。

１．将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取凝胶重量（去除空管重量），100 mg凝胶等同于 100 μL 体积，作为一个凝胶体积。

注：若回收的 DNA 片段用于克隆，须避免紫外照射损伤 DNA。尽量减少紫外暴露时间。

２．向胶块中加入 1 倍体积 Buffer PE（如果凝胶重为 0.1 g，则加入100 µL Buffer PE）。50-60℃水浴溶胶 5-10 min，期间温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块。）

３．将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，室温放置 1 min，12,000rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

注：吸附柱的容量为 750 µL，若上步得到的溶液大于 750 µL，可分批加入。

４．在吸附柱中加入 300 µL Buffer PE，12,000 rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

５．在吸附柱中加入 700 µL Buffer PW（确认已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

６．重复一次步骤 5。

７．吸附柱放回收集管后，12,000 rpm 离心 2 min，尽量除尽漂洗液。

注意：可将吸附柱置于室温放置数分钟，以防止残留的乙醇影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。

８．将吸附柱放入干净的 1.5 mL 离心管中，开盖室温静置 5 min。向吸附膜中间位置加入 30 µL Buffer PB 或 ddH2O（洗脱液应先放置于水浴锅中预热） ，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，收集DNA 溶液。

注意：洗脱体积不应小于 30 μl，体积过少影响回收效率。为了提高 DNA 的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，12,000 rpm 离心 2 min，将DNA 溶液收集到离心管中。回收大于 3 KB 的片段时，建议将 Buffer PB 预热至55 ℃以提升回收效率。DNA 也可以用 ddH2O 洗脱。DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。

蒯狡点693...问如果是双梅切,a酶用1ul,b酶用2ul,那么反应体系到底是(1+2)*10,还是2*10?2 如果反应总体积是50ul,那么10*buffer加多少,5*buffer呢,2*buffer呢... -
欧以滕18099928527 ______[答案] 1.是2*10 2.分别是50/10=5,50/5=10,50/2=25. 一般来说几*就是对buffer稀释几倍.

蒯狡点693请问,酶切中的NEBuffers是什么意思? -
欧以滕18099928527 ______ 应该是尿道炎,不是大病,积极治疗很快就会痊愈的!放心吧!用白细胞酯酶试验(let)来作尿液筛选试验,它具有敏感性、特异性较高而操作简单的特点,阳性者可作尿道炎的初步诊断.

蒯狡点693若DNA需要使用两种酶进行酶切,应如何进行? -
欧以滕18099928527 ______[答案] 如果能够找到让两种酶同时作用的最佳缓冲液NEBuffer,那就可以同时双酶切.如果找不到就只能采用分步酶切.分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始,酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求,然后加入第二种酶完成双酶切反应....

蒯狡点693BamH I 酶切不动我的质粒,怎么办呀 -
欧以滕18099928527 ______[答案] 检查一下你用的buffer是不是对的 加没有加BSA 操作有没有问题 找一个其他质粒是不是可以被BamHI切开 即酶有没有失活 反应的温度37度,时间(2h足够了) 还是不行可能你质粒上的酶切位点突变了

蒯狡点693Takara的NheI 和BamHI双酶切体系表中没有双酶切缓冲体系应该如何选用缓冲液呢?只能进行分步酶切吗? -
欧以滕18099928527 ______[答案] 1、如果你用的是Takara的酶,应该就只能分步了,而且BamHI还是30度反应,虽然也可以在37度切,但如果是分步切的话还是用30度吧. 2、为什么不用NEB的酶呢?可以用buffer1或2同时切(好像是,你需要自己再确认下),而且NEB的这两种酶...

蒯狡点693Xho1和Nde1 50μl双酶切反应体系的配制?用Xho1和Nde1对载体质粒和目的片段分别进行双酶切,50μl的酶切体系应该怎样配制?我不知道每种试剂加多少好... -
欧以滕18099928527 ______[答案] 由这两种酶组成的双酶切体系并不需要添加BSA,请你仔细核对,两种酶的最适反应温度均为37摄氏度所以双酶切温度应为37摄氏度.如果选用TaKaRa的限制性内切酶那么Buffer应使用H Buffer,对于50 μl的酶切体系而言应分别加...

蒯狡点693相隔1Kb的两个酶切位点在进行双酶切时会破坏彼此的酶切位点吗?如果会,有没有避免的方法?谢谢! -
欧以滕18099928527 ______ 这个距离隔得算是还可以啊,一般一个酶的作用位点才4-6个碱基,1000个碱基还相互干扰的比较少.如果特别担心,可以换成两次单酶切,先切A,稍微过下柱子,再切B,如果没有问题,反过来用B先切,过柱后再切A.如果两种都没问题,可能要考虑是不是两种酶一起双酶切的时候,buffer或者温度选的不合适,或者是其中一个酶产生了星号活性,有非特异切割,导致你目前碰到的问题. 如果上述都没问题,那么说明AB两个酶一起双切是不应该有问题.如果发现找不到合适的通用buffer,最后就还是只能分开切了.

蒯狡点693质粒上一种内切酶的切点只有一个吗?质粒含有多个不同种内切酶的切点? -
欧以滕18099928527 ______ 质粒上的一种内切酶的酶切位点可以有多个,比如T载体上的酶切位点就有重复的,但要看你干吗用了,一般只有一个,如果有多个酶切位点且距离比较远的话就把你的质粒切碎了,质粒上肯定还有多个不同的内切酶位点供选择,只有1个内切酶酶切位点的质粒没什么用处.

蒯狡点693要配置多少的酶切体系,载体和插入DNA的量要加多少? -
欧以滕18099928527 ______[答案] 因为内切酶的酶活性单位定义是在50ul反应体系中,最适温度反应1小时能够讲1ugDNA完全酶切的酶量.所以,一般在酶切体系里,DNA的量是可以加到非常大的.因为考虑到后期的纯化后DNA的损失问题,所以推荐酶切体系中的DNA尽量多加一些....